白芍总苷联合NB-UVB对中重度银屑病血清IL-17、IL-23和皮损PAR-2表达的影响

任国华 赵 莹

菏泽市立医院皮肤科，山东菏泽，274013

银屑病发病机制不清，目前认为与遗传、环境和免疫等多因素相关，由先天性免疫和适应性免疫系统介导，是一个累及多环节多通路的疾病。既往研究发现T淋巴细胞的失常及Th1细胞的过度活化和银屑病发病相关。白介素(IL)-23可以激活、活化辅助性淋巴细胞，更重要的是可以促进IL-17分泌，而且研究还发现IL-23水平升高可以通过IL-17/IL-23的免疫应答途径，从而增加IL-17水平的表达，进一步刺激银屑病发病与进展[1]。蛋白酶活化受体2(PAR-2)广泛分布于人体内各种组织和细胞，角质形成细胞以及血管内皮细胞是其主要效应细胞。它介导皮肤中多种功能，包括皮肤炎症和屏障功能调节等。因此PAR-2的前炎症效应有可能成为治疗皮肤炎症的一个新的靶位。

白芍总苷(total glucosides of paeony，TGP)是从白芍中提取出来的有效成分，具有抗炎、镇痛、抗病毒、保肝以及多途径抑制自身免疫反应等多种药理作用[2]。本研究通过观察白芍总苷联合窄谱中波紫外线(NB-UVB)对中重度银屑病患者的治疗效果，并研究治疗前后患者血清中IL-17、IL-23表达变化，以及皮损组织蛋白酶活化受体2表达的变化，了解其对银屑病患者的治疗效果，以及可能的治疗机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择 2019年5月至2020年6月来我院皮肤科就诊的中重度银屑病患者90例，其中男50例，女40例，年龄12～75岁，平均(43.38±9.67)岁。由同一位医师进行评估入组患者的银屑病严重程度指数(PASI)评分[3]。纳入标准：(1)通过临床医师诊断或组织病理学诊断为银屑病；(2)就诊前3个月内，未接受过糖皮质激素类、阿维A类、免疫抑制剂类等药物治疗；(3)PASI评分均≥10分。排除标准：伴有心肝肾功能不全；孕妇及年老体弱自理能力差；光敏感或者有光敏性相关疾病；近1个月内服用光敏性药物；依从性差、未完成治疗及随访者。所有患者皆签署知情同意书。所有中重度银屑病患者随机分为三组，NB-UVB治疗组、白芍总苷治疗组、白芍总苷联合NB-UVB治疗组，各30例。三组年龄病程和PASI评分无统计学差异。选择健康查体者30名为正常对照。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法 NB-UVB治疗组：采用窄谱中波紫外线光疗仪进行治疗(上海Sigma公司，ss-05)，波长为310～315 nm，峰值311 nm，全身照射。照射起始剂量为0.4 J/cm2,依据治疗反应，后续治疗剂量在前次治疗剂量基础上依次增加10%～20%，3次/周(至皮肤红斑反应维持剂量)。白芍总苷治疗组：白芍总苷口服胶囊治疗，600 mg/次，日3次。联合治疗组：为上述两组的联合治疗。疗效观察时间为3个月。

1.2.2 ELISA检测 正常对照者、所有患者治疗前及治疗后3个月，分别于清晨采集空腹静脉血5 mL，以3000 r/min的速度离心20 min，分离上层血清，所有标本放置于-70℃冰箱中保存，统一进行检测。IL-17、IL-23的表达采用双抗体夹心酶联免疫吸附法进行检测。严格按照IL-17、IL-23试剂盒(上海雅吉生物科技有限公司)说明进行相应的操作，每个检测孔设2个副孔，于波长450 nm处测吸光度(A)值。

1.2.3 皮肤标本制备 部分患者在治疗前及治疗后3个月躯干或四肢典型皮损处，用环钻切取直径大约4 mm全层皮损；正常对照组的性别、年龄及取材部位与患者相匹配，来自色素痣等非炎症皮肤，选取躯干或四肢外科手术切口边缘正常皮肤。所有皮肤组织置于4%甲醛固定液中固定。

1.2.4 皮损处PAR-2组化进行DAB染色 固定后的皮肤组织制成石蜡切片，并进行连续切片。整个流程如下：首先将切好的切片放于60℃烘箱中1 h至石蜡切片融化，依次放入100%的二甲苯、不同浓度的酒精脱蜡浸水，再加入3%双氧水以清除标本的内源性过氧化物酶活性。使用抗原修复液修复抗原后，经透膜、封闭后依次加入适当稀释的一抗、二抗、DAB显色、苏木素复染。

1.2.5 疗效判定 详细记录银屑病患者的红斑、浸润、部位以及皮损的面积大小，在治疗前和治疗后3个月分别进行 PASI 评分。

1.2.6 统计学方法 使用SPSS 22.0统计软件进行统计分析，数据以(平均数±标准差)表示，符合正态分布的连续型变量两组之间的比较使用独立样本t检验，多组资料则进行方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 治疗前、后各组患者的PASI评分比较 三组治疗前PASI评分比较,无显著差异。而治疗后，三个治疗组PASI 评分均显著低于治疗前(P<0.05)。同时，经过治疗后，联合治疗组PASI 评分显著低于白芍总苷组和NB-UVB组(P<0.05)，而后两组之间PASI 评分无显著差异(P>0.05)。见表1。

表1 治疗前后各组患者PASI 评分比较分)

2.2 治疗前后寻常型银屑病患者血清IL-17、IL-23表达 各组治疗前血清IL-17、IL-23水平均高于正常对照组，差异有统计学意义，三组间差异无统计学意义。经3个月治疗后，三组血清IL-17、IL-23水平与正常对照相比无明显统计学差异。三组治疗后血清IL-17、IL-23水平均显著低于治疗前，差异有统计学意义(P<0.05)。 见表2。

表2 各组治疗前后银屑病患者血清IL-17、IL-23水平比较

2.3 观察组前后皮损PAR-2表达情况与正常皮肤比较 治疗前可见表皮棘层增厚，上皮脚延长，表皮全层细胞膜及胞质可见较多PAR-2阳性棕黄色细颗粒状均匀分布。治疗后可见表皮厚度接近正常，表皮全层细胞膜及胞质可见部分PAR-2阳性棕黄色细颗粒状分布。见图1。

1a：正常对照组可见PAR-2在表皮全层，以及毛囊、汗腺、血管内皮细胞均有阳性表达，阳性呈胞膜及胞质棕黄色；1b、1c:NB-UVB组治疗前后皮损PAR-2表达情况；1d、1e:白芍总苷组治疗前后皮损PAR-2表达情况；1f、1g:联合治疗组治疗前后PAR-2表达情况。

2.4 各治疗组治疗前后皮损PAR-2染色的平均吸光度比较 各组治疗前皮损PAR-2染色的平均吸光度高于正常对照组，而治疗后与正常对照组无显著差异(P>0.05)，而治疗前各组比较无显著差异(P>0.05)，三组治疗后，联合治疗组平均吸光度低于两个单独治疗组，有统计学差异(P<0.05)。见表3。

表3 各组治疗前后角质形成细胞PAR-2染色的平均吸光度

3 讨论

研究发现银屑病患者皮损角质形成细胞异常分化和增殖是受免疫系统刺激，尤其是局灶性皮损的T淋巴细胞。真皮髓样树突状细胞分泌的IL-12及IL-23等炎性因子可以诱导Th17细胞的活化，后者释放致炎的Th1细胞因子。同时Th1和Th22辅助性T细胞分泌大量的TNF-α、IL-22、IFN-γ、IL-17等银屑病相关细胞因子。这些炎症因子介导的炎症反应对银屑病角质形成细胞的增殖造成影响[4,5]，而角质形成细胞是银屑病发病过程中极其重要的细胞。

IL-23/IL-17轴水平在银屑病的发病中起着关键性的作用，对与该轴相关的细胞因子进行蛋白水平以及mRNA水平表达的抑制，并调节Th17细胞相关的分化，有效控制转录因子RORγt及STAT3-mRNA等的表达，有可能成为银屑病治疗的新靶点[6,7]。

NB-UVB照射皮肤可引起一系列复杂的生物学效应，包括对朗格汉斯细胞、自然杀伤细胞(NK)、尿甘酸等的影响[8]。研究发现NB-UVB能降低银屑病患者皮损Th1细胞的活性，抑制T细胞生成并加速其凋亡，减少皮损T细胞浸润，抑制NK细胞的功能，降低患者血清中血管内皮生长因子水平，从而减轻患者表皮炎症反应[9]。

白芍总苷属于一种糖苷类分子，由天然芍药提取而来，其药理作用广泛，具有双向性多途径调节免疫反应作用。包括保肝护肾、调节脂代谢、止痛、抗炎、等多种作用。银屑病患者机体内T淋巴细胞被激活后会产生大量的炎症介质，造成Th1/Th2和Th17/调节性T细胞失衡[10]。而白芍总苷可通过其抗炎和调节细胞免疫功能的作用机制，使T细胞达到平衡状态[11]，并影响B淋巴细胞生长增殖，拮抗局部炎症因子的合成与分泌，达到高效抗炎目的。同时研究发现白芍总苷可明显抑制永生化的人角质形成细胞株(HaCaT细胞)分泌因子[12]，进而调节银屑病患者的免疫状态。

本研究结果显示通过3个月治疗，三组PASI评分都显著低于治疗前。NB-UVB治疗组和白芍总苷治疗组疗效比较无明显差异，治疗后联合治疗组PASI评分显著低于NB-UVB和白芍总苷单独治疗组。说明联合治疗组比单独治疗组在中重度银屑病的病情上治疗时间短，病情减轻快。

与正常对照组比较，三组血清IL-17、IL-23水平明显增高。而经过三个月治疗，三组患者血清IL-17、IL-23水平都降低，说明白芍总苷及NB-UVB治疗都可以有效降低炎性细胞因子水平，对治疗银屑病都有良好效果。蛋白酶激活受体属于7次跨膜G蛋白偶联受体家族，其中PAR-2在组织和细胞中分布广泛，其在某些病理状态下表达可以显著上调或下调。皮肤的角质形成细胞和真皮血管内皮细胞是PAR-2的主要效应细胞[13]，介导皮肤中的多种功能，包括皮肤炎症和皮肤屏障功能调节等。研究发现在典型的炎症性皮肤病如特应性皮炎和银屑病皮损中，角质形成细胞和血管内皮细胞PAR-2的表达显著增加[14]。由此看来，PAR-2的前炎症效应有可能是治疗各种皮肤炎症的一个新的靶点。

治疗前病灶区皮肤较厚，PAR-2阳性表达较多，在胞膜、胞质呈棕黄色细颗粒状均匀分布。三组治疗前PAR-2表达均无明显的差别，通过治疗后，联合组比其他两组比较，皮肤厚度明显变薄，接近正常皮肤。PAR-2阳性表达较少，棕黄色颗粒虽然仍呈胞膜、胞质均匀分布，但颗粒明显变小。但是三组相比较，联合组与其他两组比较，差异有统计学意义。进一步说明白芍总苷联合紫外线治疗组的治疗机制有可能和治疗后中重度银屑病皮损内角质形成细胞PAR-2表达降低有关。

综上所述，应用白芍总苷联合NB-UVB治疗中重度银屑病较单独NB-UVB与白芍总苷治疗效果更佳，可促进患者皮损恢复时间快，减轻病情，安全有效，不良反应少，大幅度提高了患者的生活质量，值得在临床中推广使用。