不同基原忍冬属药材指纹图谱的建立

王闽予，李国卫，索彩仙，潘礼业，魏 梅，孙冬梅，何嘉莹

广东一方制药有限公司，广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244

《中国药典》2015年版收载的忍冬属LoniceraL.花类药材共2种，分别为金银花（基原为忍冬属植物忍冬L.japonicaThunb.）及山银花（灰毡毛忍冬L.macranthoidesHand.-Mazz.、红腺忍冬L.hypoglaucaMiq、华南忍冬L.confusaDC.和黄褐毛忍冬L.fulvotomentosaHsu et S.C.Cheng[1]。而川银花则是列入《四川省中药材标准》2010年版，为忍冬属植物细毡毛忍冬L.similisHemsl.、淡红忍冬L.acuminataWall.的干燥花蕾或带初开的花，前者习称“南江银花”，后者习称“肚子银花”或“沐川银花”[2]。忍冬始载于《名医别录》，后《新修本草》《证类本草》均有收录[3]。《中国植物志》中记载了忍冬属植物在我国有98种之多，广泛分布于全国各省区，其中以金银花、山银花为主要商品在市场上流通，金银花以山东平邑、河南封丘为主要产区；山银花主产于湖北、云南、贵州、广西等地区；川银花则主产于四川。上述三者均具有清热解毒、疏散风热、抑菌抗菌、抗病毒的功效，主治痈肿疗疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发热等病症[4-5]。

由于金银花一直作为药食同源使用，虽然目前人工种植已成规模，但仍供不应求，加上忍冬属植物种类繁多且形态相近、功效相似，所以药材市场存在掺伪混淆等现象，因此，开展金银花与同属其它基原品种鉴别研究十分必要。目前采用HPLC指纹图谱鉴别金银花和山银花的文献较多，且鉴别多数为金银花和山银花[6-12]。本实验对忍冬、灰毡毛忍冬、黄褐毛忍冬以及淡红忍冬4个基原共47批药材进行研究，建立同时进行UPLC指纹图谱与多指标含量测定方法的基础上，结合聚类分析、主成分分析和正交偏最小二乘法-判别（partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）分析，比较不同基原忍冬属药材的差异性，为忍冬属药材鉴别和检验提供数据参考。

1 仪器与材料

Waters H-Class型超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Waters BEH Phenyl（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱；Mettler XP-26型百万分之一天平，ME204E型万分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Milli-Q型超纯水净化系统（美国Millipore公司）；KQ-500DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；甲醇、乙腈为色谱纯（Merk公司）；水为Mili-Q纯化水；其余试剂为分析纯。

绿原酸（批号110753-201817，质量分数96.8%）、马钱苷（批号111640-201808，质量分数99%）、芦丁（批号10080-201811，质量分数91.7%）、木犀草苷（批号111720-201609，质量分数94.9%），由中国食品药品检定研究院提供；异绿原酸A（批号wkq18041207）、异绿原酸B（批号wkq17060705）、异绿原酸C（批号wkq18050905）、隐绿原酸（批号wkq16081903）、新绿原酸（批号wkq16050805）、獐牙菜苷（批号wqk17092203）质量分数均为98%，由四川省维克奇生物科技有限公司提供；实验所用药材经广东一方制药有限公司魏梅主任中药师鉴定，JYH1～JYH12号样品为忍冬L.japonicaThunb.，HZ1～HZ11号样品为灰毡毛忍冬L.macranthoidesHand.-Mazz.；HH1～HH12号样品为黄褐毛忍冬L.fulvotomentosaHsu et S.C.Cheng；DH1～DH12号样品为淡红忍冬L.acuminataWall.。药材具体信息见表1。

表1 药材信息Table 1 Details of Lonicera

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Waters BEH Phenyl色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），体积流量0.3 mL/min；柱温为30 ℃；检测波长为240 nm；以乙腈（A）-0.1%磷酸（B）为流动相，梯度洗脱，0～1 min，4%～5% A；1～9 min，5%～6% A；9～13 min，6%～10% A；13～15 min，10%～14% A；15～30 min，14%～25% A。

2.2 对照品溶液制备

取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、马钱苷、獐牙菜苷、芦丁、木犀草苷、异绿原酸B、绿原酸A、异绿原酸C对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度分别为12.201、456.609、7.901、7.790、14.906、17.916、11.851、8.129、270.480、30.679 μg/mL的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

取样品粉末（过四号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，超声处理（功率300 W、频率40 kHz）30 min，放冷，用70%甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 指纹图谱方法学考察

2.4.1 精密度试验 取同一供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件连续进样6次，以绿原酸为参照峰，计算15个共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD＜2%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 取同一供试品溶液，按“2.1”项下的的色谱条件，分别于0、2、4、6、8、12 h进样测定，以绿原酸为参照峰，计算15个共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD＜2%，表明供试品溶液稳定性良好。

2.4.3 重复性试验 取样品粉末约0.5 g，平行6份，按“2.3”项下确定的方法制备供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件测定，以绿原酸为参照峰，计算15个共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD＜2%，表明方法重复性良好。

2.5 指纹图谱分析及评价

2.5.1 指纹图谱的建立及共有峰归属 采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.0版）”对47批药材样品UPLC指纹图谱进行分析，其中忍冬的色谱峰信息最丰富，确定15个共有峰（图1）；灰毡毛忍冬确定8个共有峰（图2）；黄褐毛忍冬确定9个共有峰（图3）；淡红忍冬确定11个共有峰（图4）。4者共有峰个数为8，其中2号峰（绿原酸）分离度好，峰形对称，为药材中清热、抗菌、抗病毒的主要成分之一，故以2号绿原酸峰为参照峰（S）。通过各对照品保留时间和紫外吸收光谱对药材中共有峰的化学成分进行归属，峰1为新绿原酸，峰2为绿原酸，峰4为隐绿原酸，峰7为马钱苷，峰8为獐牙菜苷，峰10为芦丁，峰11为木犀草苷，峰12为异绿原酸B，峰13为异绿原酸A，峰15为异绿原酸C（图5）。

图1 12批忍冬药材UPLC指纹图谱Fig.1 UPLC fingerprints of 12 batches of L.japonica Thunb.

图2 11批灰毡毛忍冬药材UPLC指纹图谱Fig.2 UPLC fingerprints of 11 batches of L.macranthoides Hand.-Mazz.

图3 12批黄褐毛忍冬药材UPLC指纹图谱Fig.3 UPLC fingerprints of 12 batches of Lonicera fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng

图4 12批淡红忍冬药材UPLC指纹图谱Fig.4 UPLC fingerprints of 12 batches of L.acuminata

图5 共有峰归属UPLC图Fig.5 Attribution graph of UPLC fingerprint common peaks

2.5.2 相似度评价结果 采用国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.0版本）”分别对JYH1～JYH12、HZ1～HZ11、HH1～HH12、RD1～RD12共47批药材样品UPLC指纹图谱进行数据处理，以峰2（绿原酸）为参照峰，采用平均数，时间窗口为1，自动匹配，计算相似度系数，12批忍冬药材的相似度均在0.980以上，11批灰毡毛忍冬药材的相似度均在0.986～0.999，12批黄褐毛忍冬药材的相似度均在0.791～0.981，12批淡红忍冬药材相似度均为1.000，样品相似度最高。相似度结果说明不同来源、同一基原的忍冬属药材化学成分具有较好的一致性，结果见表2。

表2 不同基原药材样品相似度评价结果Table 2 Results of similarity evalution of samples from different origins

2.5.3 不同品种药材UPLC指纹图谱和相似度比较通过UPLC指纹图谱结果显示，忍冬、灰毡毛忍冬、黄褐毛忍冬和淡红忍冬药材样品共有峰个数分别为15、8、9及11个，四者共有峰有8个。分别将上述4个基原样品的对照图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.0版本）”软件，两两对比，其中忍冬与灰毡毛忍冬、黄褐毛忍冬、淡红忍冬的相似度分别为0.856、0.575、0.880；灰毡毛忍冬与黄褐毛忍冬、淡红忍冬的相似度分别为0.800、0.979；黄褐毛忍冬与淡红忍冬的相似度为0.723。结果表明，不同基原样品间的指纹图谱共有峰信息和相似度均有差异，说明即便是同属药材，其化学成分亦存在着差异。

2.6 聚类分类

运用SPSS软件对47批药材样品进行系统聚类，采用组间平均数联结法，以余弦距离作为样品相似度的距离公式，样品聚为4类（图6）。JYH1～JYH12为忍冬聚为一类，HZ1～HZ11为灰毡毛忍冬聚为一类，HH1～HH12为黄褐毛忍冬聚为一类，DH1～DH12为淡红忍冬聚为一类。从总体数据来看，不同品种的药材样品具有明显差异。

图6 47批药材样品聚类分析结果Fig.6 Cluster analysis result of 47batches of samples

2.7 样品含量测定

基于上述研究结果，为了进一步评价4个基原忍冬属药材的质量，本研究对已进行归属的10个化学成分进行含量测定，并对结果进行多元统计分析，以区分不同基原忍冬属药材之间的差异。

2.7.1 线性范围 取“2.2”项下的对照品储备液，加甲醇稀释制得6个不同质量浓度的对照品溶液，以峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X）进行线性回归，各对照品的线性关系良好，结果见表3。

表3 回归方程及线性范围Table 3 Regression euqation and linear line

2.7.2 精密度试验 取同一供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件连续进样6次，计算新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、马钱苷、獐牙菜苷、芦丁、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C峰面积的RSD均小于2%，表明仪器精密度良好。

2.7.3 稳定性试验 取同一供试品溶液，按“2.1”项下的的色谱条件，分别于0、2、4、6、8、12 h进样测定，计算新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、马钱苷、獐牙菜苷、芦丁、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C峰面积的RSD均小于2%，表明供试品溶液稳定性良好。

2.7.4 重复性试验 取样品粉末约0.5 g，平行6份，按“2.3”项下确定的方法制备供试品溶液，按“2.1”项下的的色谱条件测定，计算新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、马钱苷、獐牙菜苷、芦丁、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C质量分数的RSD均小于2%，表明方法重复性良好。

2.7.5 加样回收率试验 精密称取已知含量的忍冬药材（JYH3）0.25 g，平行6份，加入与样品中含量等量的对照品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算加样回收率。测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、马钱苷、獐牙菜苷、芦丁、木犀草苷、异绿原酸B、绿原酸A、异绿原酸C平均加样回收率分别为94.15%、95.56%、98.19%、96.57%、98.90%、106.79%、96.40%、96.92%、98.55%、97.93%，RSD分别为2.32%、0.53%、2.57%、1.68%、1.04%、0.62%、1.84%、1.80%、1.96%、1.80%。

2.7.6 含量测定 精密称取47批样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，得到含量测定结果，见表4。结果显示，不同基原忍冬属药材的10个成分含量差异显著。经过分析多批次样品，发现獐牙菜苷、芦丁、木犀草苷为忍冬基原的差异成分；马钱苷在忍冬及淡红忍冬与其他2个基原的样品能检出；新绿原酸为4个基原样品的共有成分，但在灰毡毛忍冬中的含量明显高于其他基原，质量分数均值为5.429 mg/g，淡红忍冬次之，含量均值为2.264 mg/g，忍冬与黄褐毛忍冬中的新绿原酸质量分数较低，分别为0.707、0.613 mg/g。

2.8 多元统计分析

2.8.1 主成分分析（principal component analysis，PCA） 以10个成分含量测定结果为变量，采用SPSS 22.0软件进行主成分分析，由表5可知，共提取了3个特征值大于1的主成分，累积方差贡献率达94.026%，表明可以用3个主成分反映不同基原忍冬属药材主要的质量特征。从表6可以看出，在第1主成分有较高载荷的包括马钱苷、异绿原酸C；在第2主成分有较高载荷的包括獐牙菜苷、芦丁、木犀草苷，主要为黄酮类成分；第3主成分有较高荷载的包括新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸，主要为酚酸类成分（载荷值＞0.90）。以降维得到的3个主成分得分作为X、Y、Z轴，得到47个样品的散点分布图，结果显示，4种不同基原忍冬属样品能实现明显区分，同基原样品能较好的聚在同一区域，说明4种不同基原忍冬属药材之间的成分存在一定差异，结果见图7。从不同样品的3个主成分得分可以看出，忍冬基原的样品主成分2评分均为正值，可以较好的与其他基原的样品实现分离；淡红忍冬基原的样品主成分1评分均为正值，可以较好的与其他成分实现分离；而灰毡毛忍冬与黄褐毛忍冬的差异主要体现在主成分3，灰毡毛忍冬的主成分3评分均为正值，结果见表7。

表7 主成分得分Table 7 Principal component score

图7 PCA得分分布图Fig.7 Scatter diagram of principal component score

表5 特征根、各主成分的贡献率Table 5 Contribution rate of characteristic roots and principal components

表6 各因子初始因子载荷矩阵Table 6 Initial factor load matrix of each factor

2.8.2 OPLS-DA 依据PCA结果，对不同基原的4组样品进行OPLS-DA分析。OPLS-DA模型，R2X＝0.94，R2X＝0.955，Q2＝0.95，均大于0.5，说明模型稳定可靠，可用于不同基原忍冬属样品的区分。结果显示，数据的分类算法中OPLS-DA的效果较好，可使4种样本点完全被分开，相互之间没有样品出现交叉的情况，且全部样品均位于95%可信区间之内，结果见图8。采用变量重要性投影值（variable importance in project，VIP）筛选造成4种基原忍冬属样品差异性的标志物，其中VIP值大于1的成分包括5个，分别为新绿原酸、马钱苷、绿原酸、芦丁、木犀草苷，这些成分是造成4种不同基原忍冬属样品间成分差异的主要标志性成分，其余峰VIP值小于1，对区分样品影响较小，结果见图9。

图8 OPLS-DA得分图Fig.8 Chart of OPLS-DA score

图9 10个化学成分的VIP值Fig.9 VIP chart of 10 ingredients

3 讨论

3.1 色谱条件优化

通过全波长扫描，着重考察350 nm及240 nm 2个检测波长，通过2个检测波长的对比，发现240 nm检测波长所得到的色谱峰较350 nm检测波长的色谱峰信息多，且峰形较好，故选用240 nm作为检测波长。考察了不同色谱柱，最终确定以WatersBEH Phenyl色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）所得到的色谱图峰形最好，峰数最多。

3.2 指纹图谱结果分析

本研究建立了忍冬属药材UPLC指纹图谱，在更短的分析时间下，分离度良好，提高了分析效率。建立的指纹图谱基线平稳，共有峰数目多，忍冬药材共有峰15个，灰毡毛忍冬药材有8个，黄褐毛忍冬药材有9个，淡红忍冬药材有11个，4种忍冬的共有峰有8个，通过直观分析可以对4个基原的忍冬属药材进行区分。相似度评价结果显示不同基原之间的存在一定差异，通过聚类分析可以将同基原的样品聚为一类，说明同基原间的样品质量稳定，具有一定的共性，同时也说明不同基原间的样品其化学成分成分及含量均存在差异。

3.3 多指标含量测定结果分析

本研究在已建立UPLC指纹图谱方法的基础上，对已进行归属的10个化学成分进行定量分析，结果显示不同基原忍冬属药材的质量存在一定差异，与指纹图谱分析结果一致。其中，直观结果分析显示，金银花化学成分最丰富，含有3个差异成分（獐牙菜苷、芦丁、木犀草苷），而新绿原酸为最直观反映4种药材差异的共有成分，其含量大小为：灰毡毛忍冬＞淡红忍冬＞忍冬＞黄褐毛忍冬；主成分分析降维得到3个主成分，可以将47个样本分为基原一致的4类，其中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、马钱苷、獐牙菜苷、芦丁、木犀草苷和异绿原酸C 8个成分为区别不同基原药材的关键因素；OPLS-DA分析同样将47个样本分为3类，分类效果显著，与聚类分析、主成分分析结果一致，OPLS-DA分析显示区分不同基原样品的标志性成分分别为新绿原酸、马钱苷、绿原酸、芦丁、木犀草苷，说明OPLS-DA分析与主成分分析的评价结果一致，进一步说明不同基原忍冬属药材之间存在差异的科学性。

本研究建立了同时测定忍冬属药材的UPLC特征图谱及10个特征性成分含量的方法，采用聚类分析、PCA分析与OPLS-DA，对不同来源的47个不同基原的样本进行了分析，结果显示忍冬属4个不同基原药材存在一定差异，为忍冬属药材的质量控制提供了可靠的分析方法与参考依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突