低剂量右美托咪定可减轻早期脓毒症大鼠胃体细胞凋亡

林雅萍，朱丹丹，林 艳

(福建中医药大学附属福州市中医院麻醉科，福建 福州 350001)

脓毒症是最为常见的临床急危重症之一，其发病率及病死率高居不下[1-2]。正常的胃肠功能有助于防止肠道菌群易位，避免发生及加重脓毒症。然而，脓毒症后常常因为剧烈的全身炎性反应及血容量再分布而产生胃肠功能紊乱，甚至诱发应激性溃疡，且以胃底、胃体最为多见[3]。所以脓毒症胃黏膜保护显得尤为重要，包括制酸剂、胃黏膜保护剂的使用。近年有研究发现，右美托咪定具有免疫调节作用，可抑制细胞凋亡而减轻肠缺血再灌注损伤[4-5]。右美托咪定是新型α2肾上腺素受体激动剂，因其可靠的镇静作用，广泛应用于临床[6]。本研究旨在通过动物试验，探讨右美托咪定对脓毒症早期大鼠胃体黏膜损伤抗凋亡保护作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1动物模型及标本制备：清洁级SD健康雄性大鼠32只(购自福建吴氏实验动物公司)，体重180～220 g，随机数字法随机分为正常组(C组)，脓毒症组(S组)、脓毒症+右美托咪定高剂量组(H组)及脓毒症+右美托咪定低剂量组(L组)，每组大鼠8只(详见图1)。S组、H组及L组大鼠予腹腔注射脂多糖(1 mg/100 g)腹腔注射诱导模型[7]，并记时间轴为0时，C组大鼠腹腔注射同等剂量生理盐水。H组大鼠4 h后沿尾静脉以5 μg/(kg·h)泵注右美托咪定(Dexmedetomidine,DEX)持续2 h，L组大鼠4 h后以10 μg/(kg·h)泵注DEX持续2 h[8]，C组及S组泵注生理盐水。大鼠以固定器妥善固定后，将鼠尾浸泡在46～50℃的温水中2 min后取出，尾静脉穿刺留置针置管(26G)，固定鼠尾进行药物微注泵入。泵注结束后采用大鼠无创血压测量仪(北京软隆 BP-2010A)测量尾动脉平均动脉压、脉率。24 h后心脏穿刺采血1 ml用于白介素-6(Interleukin-6,IL-6)及肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)的检测，随后采用颈椎脱臼法处死大鼠后迅速开腹取1.0 cm×1.0 cm大小胃底组织共2份，冰盐水洗净后一份冻存于-20℃，用于Western blot检测凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9的表达；另一份于4%多聚甲醛固定用于TUNEL法检测凋亡系数。采血处死后10 min内完成标本。见图1。实验过程中动物处置方法均符合动物伦理学标准且本次研究经过本院医学伦理委员会同意。

图1 大鼠试验流程图

1.2试验材料：脂多糖(Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4)购自美国SIGMA公司(批号L2630)；右美托咪定购自四川国瑞药业有限责任公司(批号1910201)； IL-6及TNF-α采用ELISA法检测，试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司(批号SEKR-0005及SEKR-0009)；Caspase-3、Caspase-9蛋白WB检测一抗均购自Thermo Fisher公司(批号43-7800及PA5-22252)；TUNEL试剂盒购自Roche公司(批号19684817510)，组织石蜡切片经TUNEL染色后凋亡细胞被染色成深褐色，由专业人员进行阅片计数，每张片分别3次各计数100个细胞，凋亡系数=凋亡细胞/100，三次取均值为该标本凋亡系数。操作严格按照各指标说明书进行。

2 结果

2.1不同组大鼠腹腔注射脂多糖后一般情况：C组大鼠精神状态好，活动自如，毛色有光泽；S组、H组及L组大鼠腹腔注射脂多糖后1 h均有不同程度无精打采、立毛、震颤、呼吸急促。24 h后观察大鼠，S组及H组各有2只出现腹泻，所有动物均未观察到眼眶后渗出改变，各组大鼠死亡例数均为0。24 h处死大鼠剖腹可见明显浑浊腹水，肠管不同程度充血肿胀。以上症状及腹部情况表明，与C组对比，S组、H组及L组大鼠予LPS腹腔注射后均能均一化地诱导为脓毒症模型。

2.2不同组大鼠平均动脉压、脉率的比较：单因素方差分析提示三组大鼠尾动脉平均动脉压存在统计学差异，S组[(112.500±16.844)mm Hg(1 mm Hg=0.133 3 kPa)]与C组[(138.875±14.545)mm Hg]对比存在统计学差异；与S组对比，H组[(83.875±8.408)mm Hg]显著性低下，但L组[(108.25±10.389)mm Hg]与S组无差异；L组大鼠平均动脉压显著性高于H组。对比三组大鼠尾动脉脉率(次/min)提示统计学差异，腹腔注射LPS后，S组[(335.125±10.696)次/min]明显高于C组[(280.625±10.295)次/min]，同时高于药物干预的H组[(208.875±14.662)次/min]及L组[(259.500±19.741)次/min]，高剂量的H组显著性低于低剂量L组。见图2。

注：不同组大鼠尾静脉平均动脉压及脉率均采用方差分析(平均动脉压对比F值=24.099，P<0.001；脉率对比F值=105.962，P<0.001)。两两对比均采用LSD-t检验，平均动脉压对比，t(C组、S组)=26.375，P<0.005，t(S组、H组)=28.625，P<0.001,t(S组、L组)=4.25，P=0.518,t(H组、L组)=24.375，P=0.001;脉率对比，t(C组、S组)=-54.5，P<0.001，t(S组、H组)=126.25，P<0.001,t(S组、L组)=75.625，P<0.001,t(H组、L组)=-50.625，P<0.001。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，NS代表P>0.05图2 不同组大鼠尾动脉平均动脉压及脉率的比较(n=8)

2.3不同组大鼠IL-6、TNF-α的比较：对比分析三组大鼠血IL-6及TNF-α呈现相同的差异趋势，造模后S组IL-6[(94.818±9.163)pg/ml]明显高于C组[(1.240±1.023)pg/ml]，高剂量使用DEX后，H组IL-6[(76.020±11.825)pg/ml]低于S组，但与L组[(84.653±15.379)pg/ml]比较，差异无统计学意义(P>0.05)，L组与S组之间无差异。各组大鼠进行TNF-α对比，S组TNF-α[(115.281±18.962)pg/ml]高于C组[(11.848±4.539)pg/ml]，H组TNF-α[(87.774±14.007)pg/ml]低于S组，但与L组[(101.416±15.140)pg/ml]比较，差异无统计学意义(P>0.05)，L组与S组对比同样无差异。见图3。

注：不同组大鼠IL-6、TNF-α均采用方差分析(IL-6对比F值=126.225，P<0.001；TNF-α对比F值=84.808，P<0.001)。两两对比均采用LSD-t检验，IL-6对比，t(C组、S组)=-93.577，P<0.005，t(S组、H组)=18.797，P=0.002,t(S组、L组)=10.164，P=0.069,t(H组、L组)=-8.632，P=0.119;TNF-α对比，t(C组、S组)=-103.433，P<0.001，t(S组、H组)=27.507，P=0.001,t(S组、L组)=13.865，P=0.061,t(H组、L组)=-13.642，P<0.065。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，NS代表P>0.05图3 不同组大鼠血白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的比较(n=8)

2.4不同组大鼠胃底组织TUNEL染色及Caspase-9、Caspase-3蛋白表达的比较：四组大鼠进行TUNEL染色。对比C组，LPS造模后的S组大鼠胃底细胞凋亡指数显著性升高；进行DEX干预后,与S组对比，L组大鼠凋亡细胞显著性减轻，但加大DEX用量的H组并未表现出细胞凋亡减少。在Caspase-3蛋白表达量上观察到同样的差异，S组 Caspase-3蛋白表达量最高，H组及L组均低于S组，但只有L组有统计学差异。Caspase-9蛋白的表达中，H组及L组与S组对比均无显著性差异。见图4～6。

注：不同组大鼠胃体组织切片，TUNEL法染色后凋亡细胞被染成深褐色(箭头所示),400倍光学显微镜下进行凋亡细胞计数。A为C组见多数胃底细胞核淡紫色，未见明显深褐色染色细胞；B为S组，深褐色染色细胞较多，且细胞排列紊乱；C为H组大鼠胃底组织，深褐色着色细胞亦较多；D为L组大鼠，凋亡细胞较S组及H组减少图4 不同组大鼠胃体组织TUNEL染色切片(×400)

图5 不同组大鼠胃底组织Caspase-9及Caspase-3进行Western blot条带图

注：H值为各组参数进行Kruskal-Wallis H检验所得统计量，凋亡系数对比H值=24.905，P<0.001；Caspase-9相对灰度值对比H值=22.534，P<0.001；Caspase-3相对灰度值对比H值=23.673，P<0.001。两两对比采取Nemenyi法，凋亡系数对比，χ2(C组、S组)=-22.688，P<0.001，χ2(S组、H组)=-8.0，P=0.526,χ2(S组、L组)=-13.562，P=0.023,χ2(H组、L组)=-5.562，P=0.235;Caspase-9相对灰度值对比，χ2(C组、S组)=-21.0，P<0.001，χ2(S组、H组)=-4.750，P=0.311,χ2(S组、L组)=-11.250，P=0.099,χ2(H组、L组)=-6.50，P=0.166;Caspase-3相对灰度值对比，χ2(C组、S组)=-22.50，P<0.001，χ2(S组、H组)=-8.875，P=0.351,χ2(S组、L组)=-12.625，P=0.043,χ2(H组、L组)=-3.75，P=0.424。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，NS代表P>0.05图6 不同组大鼠胃底组织凋亡系数、Caspase-9及Caspase-3相对灰度值比较(n=8)

3 讨论

脓毒症后大量炎性介质进入血液循环，剧烈的炎性反应有诱导靶器官细胞凋亡，引起脏器功能损害[9]，其中急性胃黏膜病变，如应激性溃疡伴出血的发生将严重威胁患者预后[3]。本研究旨在针对脓毒症早期强烈的炎性反应风暴阶段，探讨右美托咪定对胃体黏膜的影响，本研究发现右美托咪定可降低LPS诱导的脓毒症早期大鼠的脉率，而高剂量使用DEX会使原本不高的血压进一步降低，而低剂量则对血压影响不大；监测炎性反应指标，高剂量表现出更加明显的IL-6、TNF-α下降，在低剂量大鼠中同样有下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；同时低剂量DEX干预后可减少脓毒症大鼠胃体细胞凋亡，加大剂量干预则并无统计学差异(P>0.05)。

脓毒症大鼠模型技术成熟稳定，主要有三种方式：腹腔注射脂多糖、细菌接种及盲肠结扎穿孔术造模[10]。为避免腹部手术对大鼠胃体不必要的创伤性影响，本研究采用腹腔注射脂多糖制作脓毒症模型，造模后大鼠有竖毛、寒战、呼吸急促，精神萎靡，毛松，剖腹可见浑浊腹水，恶臭，肠管充血肿胀，与李佳红等研究结果[7]相符，同时监测IL-6、TNF-α明显升高，两者在脓毒症炎性反应的评估中有重要意义[11]，表明LPS腹腔注射能够良好地诱导脓毒症大鼠模型。

右美托咪定是近年临床常用的镇静药物，因其对血流动力学的影响小、谵妄发生率低等优势受到临床医生的青睐。临床上，右美托咪定诱导的心率下降较为常见。本研究中发现右美托咪定干预后脓毒症大鼠脉率有所下降，但低剂量对尾动脉平均动脉压变化不明显，有助于维持血流动力学稳定。研究表明，右美托咪定除了有助于减轻脓毒症大鼠血流动力学的变化外[12]，同时可改善微循环[13]及抑制炎性反应、免疫调节等作用[14]，表现为降低IL-6、IL-8、TNF-α及高迁移率族蛋白B1等炎性介质的含量[4]。在此研究中同样发现右美托咪定干预后IL-6、TNF-α出现下降，只是高剂量组更加明显，而低剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)[15]，名为末端转移酶介导的dUTP末端标记法。通过标记细胞凋亡后出现的DNA末端残基，在显微镜下观察并计数，从病理组织学角度直观地评估组织细胞凋亡情况。本研究中发现脓毒症可增加胃体组织细胞凋亡，低剂量右美托咪定干预后凋亡细胞数减少，高剂量并未得到更好的效果。同样的变化趋势也发生在凋亡蛋白Caspase-3及Caspase-9的表达上。半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)家族包括多达10余种Caspase分子，主要是介导细胞内不可逆的凋亡程序[16]。本研究观察到，脓毒症大鼠无论是Caspase-9还是Caspase-3较正常大鼠均有明显增高，DEX药物干预后，低剂量组较脓毒症大鼠表现出显著性Caspase -3蛋白表达下降，而Caspase-9蛋白表达灰度比较，差异无统计学意义(P>0.05)。与此同时，高剂量干预组与脓毒症大鼠对比未见凋亡蛋白Caspase-9或Caspase-3的表达显著性差异。推测原因可能是低剂量DEX有助于维持脓毒症血流动力学稳定及其抗炎、免疫调节作用有关，改善胃体组织细胞局部微循环、减轻炎性反应损伤，从而减少细胞凋亡的发生，而高剂量DEX显著降低血压有关，胃组织低灌注带来的不良后果掩盖了DEX的抗凋亡保护作用。Caspase家族中Caspase-9负责凋亡程序起始部分，而Caspase-3是最后执行凋亡蛋白之一。至于为什么起始部分的Caspase-9没有变化而执行者Caspase-3表达明显降低？笔者给出的推测是DEX在脓毒症中与Caspase蛋白之间存在另一条启动程序模式，其中的具体分子作用机制尚不明确，有待进一步研究证实。

综上所述，腹腔注射脂多糖是一种可靠的脓毒症造模方式，同时可避免胃体组织创伤性损伤的干扰；脓毒症大鼠可出现血流动力学改变，低剂量右美托咪定干预后表现为减慢脉率、血流动力学稳定，并通过减少胃体组织细胞Caspase-3蛋白表达而减少凋亡发挥保护作用，而高剂量右美托咪定治疗并未见上述的保护作用。