银香解毒膏抑制金黄色葡萄球菌诱发皮肤炎性反应的实验研究

周 安，钱忠亚，石 洪，李爱兰，王桂兰，孙素娴，丁国兵

(泰州市姜堰中医院普外科，江苏 泰州 235500)

金黄色葡萄球菌是一种常见的革兰阳性球菌，是人类化脓感染中最常见的病原菌之一，可引起局部及全身性化脓感染，经久不愈的金黄色葡萄球菌感染甚至会导致皮肤疤痕的产生，严重的金黄色葡萄球菌感染在滥用抗生素的情况下，长期的耐药性可能会导致超级细菌的出现，诱发更严重的并发症，如皮下痈、皮下化脓性感染、脓毒血症等[1-3]。基于现况参考中医中药书籍，本研究自制银香解毒膏用于疮疡外治，具体方剂如下:金银花、乳香、蜈蚣、白芷、藿香、苦参、野菊花、黄柏、地肤子。通过建立体表感染小鼠模型即建立疮疡模型外用银香解毒膏，并同时建立莫匹罗星以及赋形剂空白对照组。采用免疫荧光观察银香解毒膏是否可以抑制巨噬细胞的招募，此外使用实时定量PCR探究银香解毒膏是否可以降低皮肤层炎性水平，初步阐明银香解毒膏的作用机制以及对比治疗效果，为银香解毒膏的未来临床应用提供一定的科学依据。

1 资料与方法

1.1小鼠实验动物及分组：选取8周龄、体重20～25 g、无特定病原的C57小鼠60只雌雄各半，将小鼠随机分为银香解毒膏组、莫匹罗星组、赋形剂组各20只(雌雄各半)；于SPF环境中以标准条件饲养，南京中医药大学实验动物中心定期对小鼠进行致病原检测以确保小鼠符合实验要求。小鼠饲养在通风洁净区，均采用SPF级洁净鼠粮进行饲养，本研究经过本院医学伦理委员会同意。

1.2方法

1.2.1主要试剂：苏木精、伊红、HistoChoice透明剂、牛血清蛋白(BSA)、DEPC水、takara逆转录试剂盒均购自Gibco 公司，多聚甲醛、抗荧光猝灭剂、DPBS、无水酒精、Triton X-100、氯仿、异丙醇原液等其常规试剂均为国产分析纯。

1.2.2标本制备：使用“胶带剥脱法”建立小鼠金黄色葡萄球菌感染模型，具体操作方法：小鼠麻醉后背部皮肤备皮剃毛，生理盐水擦拭皮肤，无菌棉球擦拭干净生理盐水，再以弹性胶带于背部皮肤上连续粘扯、撕脱动物的皮肤表皮，然后在撕脱表皮部位滴注金黄色葡萄球菌液，作用约4 h 后完成细菌吸收；当背部部位出现明显红肿、皮薄光亮、触及软化有脓液为造模成功。小鼠感染24 h后使用银香解毒膏、莫匹罗星膏、赋形剂膏进行涂抹感染部位，实验中统一用量。按照实验设计时间，分别在涂抹药物治疗后的第3天和第5天时皮肤取样，进行OCT冰冻包埋，液氮速冻1 h，-80℃冰箱冷冻48 h，使用莱卡冰冻切片机制作8 μm厚度的切片，正电荷防脱载玻片吸附冰冻切片，-20℃冰箱中冷冻保存备用。

1.2.3常规病理染色：皮肤组织切片用经典的苏木素伊红染色，用中性胶(Gibco，100 ml)固定，然后在麦克奥迪数字显微镜下观察。

1.2.4实时逆转录聚合酶链反应:PCR引物序列参考文献或在PubMed上设计，全长比对并确定序列准确无误，由Invitrogen公司合成，用DEPC水稀释后置于-80℃冰箱保存待用。PCR检测皮肤白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-1β、IL-1α的 mRNA 的表达，Trizol法提取皮肤中的总RNA，反转录为 cDNA 后进行聚合酶链反应。内参采用小鼠 GAPDH，其引物序列:上游 5'-ATTCAACGGCACAGTCAAGG-3'，下游5'- GCAGAAGGGGCCGGAGATGA-3'。目的片段引物如下：IL-6:上游 5'-AGAGACTTCCATCCAGTTGCC-3'，下游3'-CCGGACTTG TGAAGATGGGAA-5'；TNF-α:上游 5'-ACCGTCAGCCGATTTGCTAT-3'，下游 3'-CCGGACTCCGCAA-AGTCTAA-5'；IL-1β:上游5'-TGGGTTGCCAAGCCTTATCG-3'，下游 3'-TTCAGCTTCTCACCCAGGGA-5'；IL-4：上游5′-GCCATATCGGCTCGCAAATC-3′，下游 5′-AACGAATGCCGA AACCTC CTC-3′。用SYBR Green Master Mix(Qiagen)进行反应， 在95℃下引发15 min，然后将样品分别在94℃进行5 s、55℃进行30 s和70℃进行30 s，分别运行40个循环。 所有样品均重复3次。

1.3统计学分析：数据表示为来自3个独立实验的平均值±SEM。用Student's t检验进行统计分析，多重比较由ANOVA进行评估，P<0.05被认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1三组小鼠治疗3 d、5 d时常规病理染色的图像：小鼠皮肤感染金黄色葡萄球菌之后，小鼠皮肤出现水泡红肿，水泡破损后流出组织液，皮肤出现红斑并溃烂。采用赋形剂、莫匹星罗、银香解毒膏进行治疗，每组治疗3 d和5 d时通过外科手术获取皮肤标本，采用冰冻切片，进行HE染色。对比赋形剂组小鼠，通过莫匹星罗药膏治疗第5天时小鼠皮肤创面破损修复，但是皮肤乳头层出现水肿状态；通过银香解毒膏治疗小鼠的表皮层破损较小，在第5天时皮肤层愈合，皮肤乳头层没有出现水肿状态，此外原本损伤部位的皮肤乳头层出现新生毛囊样结构物。见图1。

注：三组小鼠治疗3 d和5 d的金黄色葡萄球菌感染的皮肤(n=6)，虚线内为金黄色葡萄球菌导致的皮肤损伤部位，标尺为100μm

注：(A)三组小鼠治疗3 d和5 d的炎性因子IL-6的mRNA水平;(B)三组小鼠治疗3 d和5 d的炎性因子TNF-α的mRNA水平;(C)三组小鼠治疗3 d和5 d的炎性因子IL-1β的mRNA水平;(D)三组小鼠治疗3 d和5 d的炎性因子IL-4的mRNA水平;与银香解毒膏组小鼠治疗5 d时比，①P<0.05图2 三组感染金黄色葡萄球菌的小鼠皮肤在治疗3 d和5 d时炎性因子的mRNA水平的变化

2.2三组小鼠治疗3 d、5 d时炎性因子的mRNA水平比较：三组小鼠感染24 h后分别使用银香解毒膏、莫匹罗星膏、赋形剂膏进行涂抹感染部位，分别治疗3 d和5 d后银香解毒膏可以很好地抑制金黄色葡萄球菌感染部位皮肤的炎性因子水平，IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-1α的 mRNA 的表达水平显著降低，且降低水平在一定程度上优于莫匹罗星组小鼠，差异有统计学意义(P<0.05)。以上数据说明银香解毒膏在抑制炎性因子表达水平上发挥了重要作用。见图2。

3 讨论

金色葡萄球菌正确名称为金黄色葡萄球菌，是葡萄球菌的一种，属于革兰阳性菌，培养以后显微镜下看到像葡萄串一样，所以称之为葡萄球菌。葡萄球菌主要存在于外界环境当中，很容易造成人的感染，尤其有免疫缺陷、皮肤损伤、烧伤的人，特别容易出现感染，严重的出现败血症、脓毒血症等[4]。一般消毒剂，如医用酒精大概几分钟可以灭活，所以酒精、碘伏类中效消毒剂可以很快把它灭活。但是对于皮肤深层的金黄色葡萄球菌或者已经形成生物素膜的金葡菌，一般消毒剂很难杀灭处理金葡菌，而是需要抗生素进行金葡菌的处理，但是长期使用抗生素或者反复使用同一种抗生素会促进金葡菌耐药性的发生，使得金黄色葡萄球菌感染性疾病治疗变得棘手[5-6]。这就需要一些渗透性较好的外用中药制剂来进行治疗，来抵抗滥用抗生素所导致的金黄色葡萄球菌的耐药性。

目前我院院内自制中药药剂并不多，外科临床外用中药药物颇少，应用最多仍属金黄散。如意金黄散由明代陈实功所创，首载于《外科正宗》一书，后多简称金黄散。药物组成：大黄、黄柏、姜黄、白芷、南星、陈皮、苍术、厚朴、甘草、天花粉，其运用广泛，可运用于外科疾病初起、成脓、溃后三个时期。基于现况参考中医中药书籍,我院自制银香解毒膏用于疮疡外治,具体方剂如下:金银花、乳香、蜈蚣、白芷、藿香、苦参、野菊花、黄柏、地肤子。其中金银花与野菊花成分具有很好的清热解毒的功效，且主治痈疽疔疖等皮肤感染性疾病，此外地肤子等成分可以起到解毒祛湿、消肿止痒的功效。炎性反应的主要表现为红肿热痛，而在蛋白分子层面炎性细胞因子反应了炎性反应水平。在本研究中，银香解毒膏很好地抑制了 IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-4的mRNA的表达水平，从而控制了皮损程度。这些炎性细胞因子大多数由炎性细胞分泌，因此从细胞层面上来分析银香解毒膏很大程度上抑制了炎性细胞的招募。研究报道金黄色葡萄球菌感染皮肤后对皮肤造成直接的损伤，而中性粒细胞等炎细胞招募会诱发损伤部位的“二次打击”[7-8]，炎性细胞的围攻将会加重皮损损伤程度，甚至损伤毛囊的正常结构，导致毛囊坏死、毛干脱落，让坏死的毛囊无法再发挥毛囊干细胞的修复功能，从而形成皮肤瘢痕，严重影响了患者的外表美观，甚至影响患者的心理健康。

本研究结果显示，银香解毒膏可以很好地缓解金黄色葡萄球菌导致的皮肤炎性反应，对于金黄色葡萄球菌的感染具有很好的治疗效果，维护皮肤正常功能。然而对于银香解毒膏杀灭金黄色葡萄球菌的具体机制还需进一步探究，后期阐明银香解毒膏药物渗透动力以及对金黄色葡萄球菌生物素膜的抑制机制，对于未来临床药物的推广应用具有一定的指导意义。