复方小钻方3种颗粒剂对慢性盆腔炎大鼠的影响

陈柯贝，黄小妹，莫桂梅，曾诗颖，吴玉强,2*

(1.广西中医药大学 药学院，广西 南宁 530200；2.广西中医药大学 制药厂，广西 南宁 530023)

0 引言

慢性盆腔炎症(Chronic pelvic inflammatory disease，CPID)是妇科常见慢性疾病，以盆腔、子宫内膜、腹膜和输卵管等部位慢性炎症为特征，临床主要症状是下腹钝痛，伴随白带增多、痛经等[1].CPID为顽症，易复发，难根治，不及时治疗可导致不孕、卵巢输卵管囊肿，甚至增加罹患输卵管癌、卵巢癌、子宫癌的风险[2].目前，左氧氟沙星(Levofloxacin)是治疗盆腔炎常用的有效药物，但长期使用易产生耐药性，且CPID多伴随粘连和增生，西药治疗效果并不理想[3].

复方小钻方，由小钻、千斤拔、救必应、鸡血藤、飞龙掌血和一匹绸组成，具有活血通络、散瘀消肿之功效，是广西中医药大学第一附属医院临床治疗CPID的临床验方，在临床上应用效果显著[4].已有报道，小钻[4]、千斤拔[5]等有治疗CPID的作用.本研究采用水提，醇提及醇提后水提等3种不同的提取方法，并制成颗粒，利用大鼠CPID模型，该模型与人类CPID的病理特点相似[6]，观察3种小钻颗粒对CPID大鼠的作用及机制，为复方小钻方的进一步制剂工艺研究和临床应用提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 实验药物及试剂

3种小钻颗粒，按提取方式分为颗粒Ⅰ(水提物颗粒，1 g颗粒相当于原药材6.42 g)、颗粒Ⅱ(醇提物颗粒，1 g颗粒相当于原药材9.15 g)和颗粒Ⅲ(醇提后水提混合颗粒，1 g颗粒相当于原药材5.48 g)，由广西浦北制药厂提供，批号分别为202011080003、202011090001和202011100001；花红片，广西壮族自治区花红药业股份有限公司，批号20180306；盐酸左氧氟沙星片，山东鲁抗医药集团赛特有限责任公司，批号191002；水合氯醛，成都市科隆化学品有限公司，批号2018041601；白介素1β(IL-1β)、IL-6试剂盒，欣博盛生物有限公司，批号分别为R200901-007a和R2010001-003a；SOD和MDA试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号分别为20201007、20200716和20200930；4%多聚甲醛，兰杰柯科技有限公司，批号70061000；羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，天津市大茂化学试剂厂，批号20171215.

1.2 实验仪器

JM-A5002型电子天平，诸暨市超泽衡器设备有限公司；SQP型分析天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；TGL-16G型离心机，上海安亭科学仪器厂；M200PRO型酶标仪，瑞士Tecan公司；LRH-250-A型生化培养箱，广东泰宏君科学仪器股份有限公司；XT-2000i型全自动血液分析仪，日本SYSMEX公司；DW-86L630型-80℃冰箱，澳柯玛股份有限公司等.

1.3 实验动物及饲养环境

SD大鼠，雌性，SPF级，购自广西医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证号为SCXK 桂2020-0003，饲养于广西中医药大学实验动物中心，IVC塑料笼盒内，饲养环境符合SPF级要求，实验动物使用许可证号为SYXK(桂)2019-0001.

1.4 药液的配制

(1)水提物药液的配制：取14.22 g颗粒Ⅰ，加0.5%CMC-Na至100 mL，充分混悬，即得水提物低剂量药液(0.9 g/mL，药物浓度及剂量按生药量计)，同法配制水提物高剂量药液(1.8 g/mL).

(2)醇提物药液的配制：取9.84 g颗粒Ⅱ，加0.5%CMC-Na至100 mL，充分混悬，即得醇提物低剂量药液(0.9 g/mL)，同法配制醇提物高剂量药液(1.8 g/mL).

(3)醇提后水提物药液的配制：取16.43 g颗粒Ⅲ，加0.5%CMC-Na至100 mL，充分混悬，即得醇提后水提物低剂量药液(0.9 g/mL)，同法配制醇提后水提物高剂量药液(1.8 g/mL).

1.5 模型的复制

取雌性SD大鼠，适应性饲养7 d后，禁食不禁水14～16 h.使用10%水合氯醛麻醉大鼠，打开腹腔，暴露左侧子宫，取10 mL注射器针头(去针尖)于子宫交汇点分别向左侧子宫进针，在子宫腔抽拉2次，并注入细菌混合液0.1 mL(由广西中医药大学微生物免疫学教研室提供，大肠杆菌∶金黄色葡萄球菌=1∶1，细菌密度为3×109/mL)[7,8]，假手术组大鼠8只，仅进行开腹找到左侧子宫操作，术后，逐层缝合切口，碘伏消毒，并每天1次，术后连续碘伏7 d.

造模第10天，取模型大鼠72只随机分为9组，即颗粒Ⅰ低、高剂量组(9、18 g/kg)，颗粒Ⅱ低、高剂量组(9、18 g/kg)，颗粒Ⅲ低、高剂量组(9、18 g/kg)，花红片组(870 mg/kg)，左氧氟沙星片组(42 mg/kg)[8]和模型组，每组8只.假手术组和模型组大鼠，按10 mL/kg灌胃0.5%CMC-Na，其余大鼠按10 mL/kg灌胃对应浓度的颗粒Ⅰ、颗粒Ⅱ、颗粒Ⅲ药液或花红片药液或左氧氟沙星片药液，每天1次，连续28 d.记录给药前、终末体重及每周体重.

1.6 采血及血常规检测

禁食不禁水14～16 h，末次给药后1 h，10%水合氯醛麻醉(300 mg/kg)，腹主动脉采血，用EDTA-K2抗凝管收集抗凝血，使用全自动血液分析仪检测白细胞总数(WBC)和中性粒细胞(NEUT)水平[7].

1.7 子宫肿胀度和肿胀率

采血结束，迅速分离左右侧子宫，计算子宫肿胀度(g)和肿胀率(%).子宫肿胀度=左侧子宫质量-右侧子宫质量；子宫肿胀率=100%×子宫肿胀度/右侧子宫质量[9].

1.8 血清IL-1β、IL-6、SOD和MDA水平

按试剂盒说明书要求，检测血清IL-1β、IL-6、SOD和MDA水平.

1.9 统计学分析

采用SPSS17.0进行数据统计，计量数据以(±s)形式表示.多组间比较进行One-Way ANOVA分析，两组间比较采用LSD法分析(方差齐)或Dunnett's T3法分析(方差不齐).当P<0.05则认为数据差异具有统计学意义.

2 结果与讨论

2.1 体质量

由表1可见，与假手术组比较，给药前及给药4 w后，模型组大鼠体质量及增长均显著降低(P<0.05或P<0.01)；与模型组比较，给药4 w后，小钻颗粒Ⅰ低、高剂量组大鼠体质量及增长均增加，其中高剂量组大鼠体质量显著增加(P<0.05)，低、高剂量组大鼠体质量增长显著增加(P<0.05或P<0.01)；颗粒Ⅱ低、高剂量组大鼠体质量及增长均显著增加(P<0.05或P<0.01)；颗粒Ⅲ低、高剂量组大鼠体质量及增长均增加，其中高剂量组大鼠体质量及增长显著增加(P<0.05或P<0.01).

表1 三种小钻颗粒对慢性盆腔炎大鼠体质量的影响

2.2 子宫肿胀度和肿胀率

由表2可见，与假手术组比较，模型组大鼠左、右侧子宫质量，子宫肿胀度及肿胀率均显著增加(P<0.01)；与模型组比较，小钻颗粒Ⅰ低、高剂量组大鼠左、右侧子宫质量，子宫肿胀度及肿胀率均降低，其中高剂量组大鼠右侧子宫质量及肿胀率显著降低(P<0.05或P<0.01)，低、高剂量组大鼠左侧子宫质量及子宫肿胀度显著降低(P<0.05或P<0.01)；颗粒Ⅱ低、高剂量组大鼠低、高剂量组左、右侧子宫质量，子宫肿胀度及肿胀率均显著(P<0.05或P<0.01)；颗粒Ⅲ低、高剂量组大鼠左、右侧子宫质量，子宫肿胀度及肿胀率均降低，其中低、高剂量组大鼠左侧子宫质量，子宫肿胀度及肿胀率显著降低(P<0.05或P<0.01).

表2 三种小钻颗粒对慢性盆腔炎大鼠子宫肿胀度和肿胀率的影响

2.3 血常规

由表3可见，与假手术组比较，模型组大鼠血液白细胞总数、中性粒细胞百分比均显著增加(P<0.01)；与模型组比较，3种小钻颗粒低、高剂量组大鼠血液白细胞总数、中性粒细胞百分比均显著降低(P<0.05或P<0.01).

表3 三种小钻颗粒对慢性盆腔炎大鼠血常规的影响

2.4 血清IL-1β、IL-6、SOD和MDA水平

由表4可见，与假手术组比较，模型组大鼠血清IL-1β、IL-6和MDA水平显著升高(P<0.01)，SOD水平显著降低(P<0.01)；与模型组比较，除颗粒Ⅰ低剂量组大鼠血清MDA水平差异不具显著性(P>0.05)外，3种小钻颗粒各剂量组大鼠血清IL-1β、IL-6和MDA水平均显著降低(P<0.01)，SOD水平显著升高(P<0.05或P<0.01).

表4 三种小钻颗粒对慢性盆腔炎大鼠血清IL-1β、IL-6、SOD和MDA水平的影响

祖国医学认为，CPID属于“癥瘕”、“带下”、“积聚”、“腹痛”等范畴，与宋代陈自明《妇人良方》记载的“积聚”、“癥瘕”病症一致，主要由于经期、孕期等体虚不能捍邪，邪从外入，胞宫经脉受损，血脉不通，不通则痛，CPID 的病机为血瘀[10]，治疗当活血化瘀、行气止痛.现代医学认为，CPID是由于经期不洁或流产等多种原因，导致子宫致炎菌感染，久不能愈，炎症部位大量细胞坏死，胶原蛋白分泌形成结缔组织增生，属于病理Ⅱ愈合的范畴.由于结缔组织不是正常的细胞，不能清除细菌，只能将其包裹，限制其致炎作用，即形成病灶，但当人体抵抗力下降时，细菌致炎作用突破病灶，炎症反应刺激腹部神经，就会出现腹部钝痛.治疗的关键，一是抗菌，二是促进炎症部位愈合，最好能根治病灶.西药抗菌作用强，但对结缔组织包裹的病灶无作用，故很难根治.中药，特别是活血化瘀药，可抑制成纤维细胞增殖，减少胶原合成，从而减少结缔组织形成，清除病灶，抗炎促愈合[11].

复方小钻方，以小钻为君药，祛风活血、行气止痛、散瘀消肿，有报道其有抗类风湿性关节炎[12]、抗炎镇痛[13]、抗肿瘤[14]等作用；以千斤拔、救必应和鸡血藤为臣药，千斤拔祛风除湿、舒筋壮骨、活络散瘀、解毒，有报道其有抗炎[15]、调节机体免疫[16]等作用，救必应泻火解毒、清热利湿、行气止痛、凉血止血，有报道其有抗菌[17]、镇痛抗炎[18]等作用，鸡血藤行血补血，调经，舒筋活络，有报道其有活血、补血、抗氧化等[19]作用；佐以飞龙掌血和一匹绸，飞龙掌血散瘀止血，祛风除湿，消肿解毒，有报道其抗炎镇痛、活血、抗菌、和抗肿瘤等[20]作用，一匹绸蠲痹利水，散瘀止血，拔毒生肌，有报道其抗炎镇痛等[21]作用.针对CPID的病理特点，复方小钻方诸药合功可活血化瘀、行气止痛，同时又可清热解毒以抗炎消肿，补血增强免疫力以达祛邪而不伤正的目的.

有研究表明，CPID主要病原菌为沙眼衣原体、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等[22]，故本研究采用机械损伤子宫内膜，同时注射大肠杆菌加金黄色葡萄球菌，使子宫内膜感染病原菌，10 d的炎症反应，大量子宫内膜细胞坏死甚至子宫穿孔，胶原蛋白分泌增加，形成了结缔组织，模型组腹部可见广泛粘连，大鼠体重减轻，子宫肿胀度及肿胀率显著增加，血液白细胞总数、中性粒细胞百分比显著增加，血清致炎细胞因子IL-1β和IL-6水平显著升高，血清氧化自由基MDA水平显著升高，抗氧化指标SOD水平显著降低，说明机械损伤加注射大肠杆菌加金黄色葡萄球菌复制的大鼠慢性CPID模型成功.

本研究结果表明，复方小钻方3种颗粒剂均能使CPID模型大鼠体重增加，降低子宫肿胀度及肿胀率，降低血液白细胞总数和中性粒细胞百分比，降低血清致炎细胞因子IL-1β和IL-6水平，降低血清氧化自由基MDA水平，升高血清抗氧化指标SOD水平.说明复方小钻方3种颗粒剂对大鼠慢性CPID具有良好的治疗作用，其机制可能与抑制促炎因子表达，增强机体抗氧化能力有关.

3 结论

本研究按提取方式对复方小钻方3种颗粒进行拮抗大鼠慢性CPID，其等效剂量9 g原药材/kg均有效，说明复方小钻方对大鼠慢性CPID具有良好的治疗作用，在本实验中，小剂量(临床剂量)组颗粒Ⅰ对CPID大鼠血清MDA水平、子宫肿胀率影响作用不显著(P>0.05)，颗粒Ⅲ低剂量组体质量增长作用不显著(P>0.05)此外，颗粒Ⅰ临床服用量为13.14 g，颗粒Ⅱ临床服用量为9.29 g，颗粒Ⅲ临床服用量为15.51 g，颗粒Ⅱ服用剂量少，此外，颗粒Ⅱ提取工艺较颗粒Ⅲ简单，结合制剂工艺、药效学研究数据和病人的顺应性考虑，故认为颗粒Ⅱ更适合大工业化生产.

综上认为，复方小钻方制成颗粒剂，适合用于临床治疗慢性盆腔炎，但制剂工艺及药效机制尚有待进一步研究.