基因芯片法鉴别饲料中猪、牛、鸡和鸭等动物源性成分分析

石丰运 朱广琴 顾开朗 王 兵

（徐州生物工程职业技术学院动物工程学院，江苏徐州 221100）

目前，由于非洲猪瘟疫情的影响，导致牛肉粉、鸡肉粉、鸭肉粉等饲料原料中掺杂猪肉粉现象频发，此现象导致疾病的防控难度增大，同时对很多企业的发展产生了不利的影响，有必要采用科学的方法来对动物源性成分进行检测分析，以此发现在原料以及相关制品中存在的问题。当前对于动物源性成分检测的研究逐步增多，形成了多种类型的检测方法，一般划分为2种，第1种是蛋白质检测法（常用的有ELISA[1]、色谱法[2]等），第2种是核酸检测方法（包括PCR方法[3,4]等）。然而此类方法依然无法满足实际检测的要求。因此，需要在动物源性成分检测方面进行更深入的研究，进一步提升检测的效率和精度，旨在确保我国动物饲料产品的安全使用。本研究主要采用基因芯片检测法，选取mtDNA 18S rRNA作为靶基因，在优化PCR扩增体系之后构建了基因芯片检测方法，实现了对动物源性成分的检测。

基因芯片技术在应用过程中需要先对样本核酸进行荧光标记，然后再进行杂交，并将未有效结合的DNA片段进行剔除，在此基础上扫描芯片，以此可以对杂交信号的强度进行有效地检测。针对采集到的数据采用专业的软件进行处理，可以得到需要的样本序列信息[5,6]。基因芯片技术的优势在于性价比高、高通量等，属于一种新型的检测技术[7-9]。

1 材料与方法

1.1 样品

研究采用的检测样品均由江苏省徐州市的饲料企业提供，主要有鸡肉粉、牛肉粉、猪肉粉、狗肉粉、鱼肉粉等15种。

1.2 试剂和仪器

采用的试剂主要如下：Ex Taq DNA聚合酶、DNA Marker DL 2 000等来自于生工生物工程（上海）股份有限公司；核酸杂交液来自于南京森贝伽生物科技有限公司；DNA提取试剂来自天根生化科技（北京）有限公司；醛基化DNA芯片基片等来自北京博奥晶典生物技术有限公司。

试验中采用的仪器如下：Axon的激光共聚焦扫描仪（GenePix4200A）；BioDot的GenePix 4200A扫描仪；Gene Genius的凝胶成像系统；DU800（Beckman）；北京六一仪器有限公司的ABI Verti PCR仪。

1.3 引物和探针

研究中参照并设计了通用引物、检测性探针，主要基于Oligo 6.0设计，并通过上海英骏生物技术有限公司合成。质控探针主要有阴性质控探针等。通用引物、检测探针及质控探针序列信息如表1所示。

表1 通用引物、检测探针及质控探针序列

1.4 芯片的制备

制备芯片过程中需要依据合理的流程进行操作，首先需要通过1×TE缓冲液对固相探针进行溶解，并达到40 μmol/L的要求。然后依次在384孔中添加0.5 g/mL DMSO混合液、探针溶液，二者均为10 μL，添加完成后混合均匀，以50%DMSO作为对照。在基片点样结束后需要先置于温度控制在37℃的烘箱内保持12 h；上述过程完成后进行漂洗并置于2 g/L NaBH4中0.25 h；最后进行漂洗、离心等操作，并将最终的产物置于避光条件下存储，温度保持在4℃。

表2 基因芯片探针排布情况

1.5 荧光标记PCR扩增

PCR反应体系：正、反向引物（10 μmol/L）均为0.5 μL；10×缓冲液、Cy5-dNTPs 分别为 3.0 μL、0.4 μL；Taq 聚合酶 0.2μL（5 U/mL）；DNA 模板（10～20 ng/μL） 1 μL、加 dd H2O 补足至 25 μL。采用H2O作为对照组，便于进行对比分析。扩增条件依次进行4个处理过程，分别是预变性、变性、退火以及延伸处理，各个阶段的处理时间分别为5 min、0.5 min、0.5 min、0.5 min，温度分别为 95℃、94℃、58℃、72℃，循环次数为35；在上述过程结束后进行延伸，时间为10min，温度为72℃，最后凝胶成像系统分析结果。

1.6 芯片杂交及扫描

选取适量的PCR标记产物、Cy5阳性探针互补链、芯片杂交液，分别为5 μL、1 μL、6 μL；变性处理时间为4 min，温度为94℃；冰浴3 min。加入点样区进行杂交，时间为1.5 h，烘箱温度控制在55℃。结束后将产物置于43℃洗液I（0.3×SSC）、洗液Ⅱ（0.06×SSC）清洗，时间均为5 min；最后进行离心处理，时间为150 s，1 500 r/min；离心完成后进行干燥。

1.7 特异性试验

为更好地评价小芯片技术的特异性，在试验中选取了15种不同种的动物源性肉粉，进行PCR扩增，并对得到的产物进行进一步分析和处理，便于对特异性进行分析。

1.8 灵敏度试验

在试验过程中采用核酸蛋白分析仪测定提取样品DNA的质量浓度，其中DNA模板母液设置为100 ng/μL，然后进行稀释，梯度主要有6个，即10-1～10-6，用于灵敏度试验检测（图1）。

图1 灵敏度试验PCR电泳图

2 结果与分析

2.1 荧光标记PCR扩增结果

将猪、牛、鸡、鸭等的DNA模板应用荧光标记法进行PCR扩增，结果见图2，猪、牛、鸡、鸭的4对通用引物有效扩增出PCR产物序列长度分别在233 bp、233 bp、238 bp和239 bp，空白对照无扩增条带，表明本试验所建立的PCR反应体系特异性强、准确性好，为下一步探针能够有效特异性杂交提供了条件。

图2 通用引物动物源性PCR扩增图

2.2 基因芯片特异性检测结果

对引物进行PCR扩增，基于1.6方法完成杂交过程，结果（如图3）发现4条探针和产物的杂交信号均正常，而与其他产物则不存在杂交信号。另外，试验中未发现假阳性数据。由此证明，采用基因芯片技术具有较高的可靠性与准确性，能够有效检测出4种动物源性成分类型。结合上述分析，可以基于该方法实现对饲料成分的特异性检测。

图3 特异性检测杂交结果

2.3 基因芯片灵敏度检测结果

在试验过程中采用的材料主要是鸭肉粉、牛肉粉，检测是否可以达到较高的灵敏度要求。试验中选择的反应模板主要是5 μL猪、鸭DNA溶液，二者含有的DNA依次为 5 000 pg、500 pg、50 pg、5 pg、0.5 pg、0.05 pg，对应着图中所示的序号为1～6。在PCR扩增完成后进行杂交反应，特异性结合位点信号随DNA浓度的降低而不断变弱（图4），即二者体现出一定的正相关性。根据最终得到的试验结果可知，杂交信号的强弱与2种材料的强弱直接相关，在二者含量为10-6时，没有形成杂交信号；而达到10-5的含量时，形成了杂交信号，但是并不显著。所以可以认为检测的灵敏度达到了10-5。

图4 基因芯片的灵敏度检测结果示意图

2.4 基因芯片稳定性检测结果

针对通用引物进行PCR荧光标记扩增，根据1.6基因芯片杂交方法，进行批次间和批次内重复试验。试验结果表明在相同杂交条件下，批次间和批次内的杂交信号较为稳定，信号中位值的变异系数均小于5.15%，试验检测结果显示不同批次或同一批次的基因芯片均具有较好的可重复性。

3 讨论

近年来，基因芯片检测技术发展迅速，应用潜力巨大，并开始应用到了生物成分检测中。其应用的优势体现在高通量、高灵敏度、高精度、高效率等方面，显示出良好的应用前景[11]。本研究主要分析了基因芯片法对饲料中动物源性成分检测的应用，并通过PCR结合基因芯片技术完成了检测的过程，达到了较好的检测效果。由此可知，在饲料中的动物源性成分检测中可以采用基因芯片检测方法，且基因芯片检测法在检测的效率以及精度上均可以满足实际检测的要求。

重点分析了基因芯片检测方法的特异性主要与通用引物以及目标基因有关。在试验中设计了不同动物的特异性探针，并结合通用引物进行选择，进一步提高了检测结果的准确性。此外，还针对基因芯片检测技术的灵敏度和重复性进行了试验，根据得到的试验结果可知，在检测鸭肉粉、猪肉粉时的灵敏度较高，达到了10-5。相对于常规PCR等检测技术，在检测灵敏度上体现出一定的优势[12,13]，适合于应用到实际的动物源性成分检测中，确保饲料以及其他肉制品达到较高的质量要求。

采用的PCR—基因芯片检测技术显示出一定的优势，在动物源性成分检测中灵敏度较高，同时特异性比较显著，可以同时对不同类型的动物源性成分进行检测。研究主要以饲料中鸡、鸭、猪、牛等4种动物源性成分的检测为例进行了分析，验证了该方法的应用效果，为其他饲料中的动物源性成分检测提供了借鉴。此外，基于该技术进行动物源性成分检测的效率较高，节约了检测的时间，降低了检测成本，为国内肉制品以及饲料成分的检测提供了理论支撑。由此可知，该基因芯片检测技术显示出较大的应用潜力，能够为实际的检测工作提供必要的保障。