水稻幼穗响应盐胁迫的转录组分析

吴孚桂 刘慧芳 聂佳俊 韦云飞 马启林

摘  要：盐胁迫是影响作物生长发育的重要环境因素之一。鉴定水稻耐盐新基因以及揭示其可能的机制并应用于新种质创制和新品种选育，是提高水稻耐盐性的重要途径之一。本研究以实验室自主选育的耐盐性不同的水稻品系58M和58L为材料，用0.6% NaCl处理0、6、24 h后收集水稻的幼穗，并进行转录组测序研究。结果发现，以0 h的幼穗为对照，58M品系在盐胁迫6 h后检测到表达上调基因1483个，下调基因1085个;盐胁迫24 h后上调基因937个，下调基因459个。58L品系在盐胁迫6 h后有931个基因上调，2614个下调基因;盐胁迫24 h后有930个基因上调，1299个下调基因。通过韦恩图分析发现，盐胁迫6 h后有178个基因在58M品系中上调，在58L中下调;盐胁迫24 h后有30个基因在58M品系中上调，在58L中下调。将这208个目标基因进行GO功能富集分析与KEGG pathway分析，GO分析发现，这些差异基因在生物学过程、细胞组分和分子功能3个主类中，分别占40.43%、31.56%和28.01%;KEGG Pathway分析结果表明，这些差异基因显著富集的通路包括二萜类生物合成、氨基酸糖与核苷酸糖代谢、苯丙烷生物合成、生物素代谢、代谢通路、次生代谢产物的生物合成、α-亚麻酸代謝、脂肪酸生物合成和不饱和脂肪酸的生物合成等。另外，通过对目标基因的挖掘共发现5个重要的转录因子。本研究通过水稻幼穗转录组分析，为研究幼穗耐盐分子机制提供参考。

关键词：水稻;幼穗发育;盐胁迫;转录组;转录因子

中图分类号：S511      文献标识码：A

Abstract： Salt stress is one of the important environmental factors affecting crop growth and development. Identifying new salt tolerance genes and revealing their possible mechanisms and applying them to the creation of new germplasm and the selection of new varieties is one of the important ways to improve the salt tolerance of rice. In this study， 58M and 58L strains with different salt tolerance independently selected by the laboratory were used as experimental mate-rials. The young panicles of rice were collected after treatment with 0.6% NaCl for 0， 6 and 24 h， and the transcriptome sequencing study was conducted. The results showed that with 0 h young ears as the control， the 58M strain detected 1483 genes up-regulated and 1085 genes down-regulated after 6 h salt stress; 937 genes were up-regulated and 459 were down-regulated after 24 h salt stress. In the 58L strain， 931 genes were up-regulated and 2 614 were down-regulated after 6 h salt stress; 930 were up-regulated and 1 299 were down-regulated after 24h salt stress. Through the Venn diagram analysis， it was found that 178 genes were up-regulated in 58M strains and down-regulated in 58L after 6h salt stress; 30 genes were up-regulated in 58M and down-regulated in 58L after 24 h salt stress. These 208 target genes were subjected to GO function enrichment analysis and KEGG pathway analysis. GO analysis found that these differential genes accounted for 40.43%， 31.56% and 28.01% respectively， in the three main categories of biological process， cellular component and molecular function; KEGG Pathway analysis results showed that the pathways of these differential genes were significantly enriched include diterpene biosynthesis， amino acid sugar and nucleotide sugar metabolism， phenylpropane biosynthesis， biotin metabolism， metabolic pathways， biosynthesis of secondary metabolites， α-linolenic acid metabolism， fatty acid biosynthesis and biosynthesis of unsaturated fatty acids etc. In addition， a total of five important transcription factors were discovered through the mining of target genes. This study would provide a reference for studying the molecular mechanism of salt tolerance in young panicles through transcriptome analysis of rice young panicles.

Keywords： rice; young panicle development; salt stress; transcriptome; transcription factor

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.05.011

水稻（Oryza sativa L.）作为世界上主要的粮食作物之一，养活将近世界1/2的人口，在世界粮食生产和广大消费粮食作物中占据着重要位置。盐胁迫是导致水稻减产的重要环境因素之一，严重时甚至会导致植株死亡，直接影响水稻生产的稳定性[1-2]。世界上现有盐碱地约9.6×109 hm2，仅中国就有1×109 hm2左右，约占整个世界盐碱地的10%[3]，中国稻田受盐分侵害的面积约占可耕种面积的1/5[4]。采用合适的水土管理技术和化学改良剂虽然能够减缓盐分对水稻的侵害，但是因其耗资大、见效少而无法大规模推广[4]。因此，对水稻耐盐性开展深入研究，增强水稻的耐盐性，选育耐盐的水稻品种，是确保盐碱地区粮食安全和改善生态环境的有效途径。

幼穗分化发育是水稻产量形成过程中一个极其关键的时期，也是水稻对盐胁迫最为敏感的时期[5]。整个幼穗分化分为2个阶段，前半段主要是颖花的发育，这个阶段是决定每穗总颖花数多少的关键时期，总颖花数不足时，即便是拥有再高的结实率，也不能达到所期望的产量;后半段是颖花能否正常发育及花粉形成的时期，是决定颖花是否退化和花粉育性的关键时期，影响最终的穗粒数和结实率[6]。要想获得高产，在幼穗发育过程中，增加每穗颖花数，减少颖花退化和提高结实率是关键。目前，对于盐胁迫对水稻幼穗发育的影响知之甚少，探明水稻幼穗分化发育对盐胁迫的敏感时期、耐受程度、在盐胁迫条件下的形态和生理变化规律以及耐盐相关基因的表达差异，对于进一步认识水稻耐盐机理，培育耐盐水稻品种和指导盐碱地水稻生产都具有重要的理论和实践意义。

本研究采用高通量测序方法——转录组测序（RNA-Seq）技术对水稻幼穗进行了研究，增加了幼穗在盐胁迫条件下抗性形成机理的认识，为后续进行幼穗的耐盐性研究提供理论基础。另一方面，通过对盐胁迫下幼穗中差异基因的分析，能够加速幼穗中耐盐新基因以及与耐盐相关基因的鉴定，对其可能的机制进行研究分析，为水稻种质创新和新品种的选育工作提供了相关的理论依据。

1  材料与方法

1.1  材料

水稻品系58M（耐盐性较强）和58L（耐盐性一般），是海南大学热带作物学院实验室从同一个诱变群体中筛选得到的性状稳定且耐盐性不同的2个新水稻品系。

1.2  方法

1.2.1  盐胁迫处理  选取水稻品系58M和58L的饱满种子，在培养皿中发芽后播种于海南大学热带作物学院农科基地中的水稻池中。待秧苗长到4片叶左右将其进行盆栽，盆的规格为直径30 cm，高40 cm，每盆4株，共48盆。在幼穗分化阶段剥检幼穗，观察幼穗长到2 cm左右时进行盐胁迫处理，盐浓度为0.6%，分别在盐处理后0、6、24 h取样，剥检符合要求（幼穗長2 cm左右）的幼穗，放入液氮中速冻，随后放入?80 ℃保存备用，委托广州基迪奥生物科技有限公司完成RNA的提取、质控、建库及Illumina HiSeq?TM 6000测序工作，每个时间点取样都进行3次重复。

1.2.2  数据组装  为了保证数据质量，在信息分析之前要对原始数据进行数据过滤，以减少无效数据带来的分析干扰。将下机的原始数据过滤剔除质量较低与拼接处的数据，然后通过比对剔除高质量数据中包含rRNA的数据;之后将过滤完rRNA的数据与参考基因组进行序列比对，再进行转录本重构，最后得到所有的转录组数据。

1.2.3  GO注释及Pathway分析  利用Deseq 2软件对差异基因进行筛选，筛选的标准为|log2FC|>1和FDR<0.05，最后将筛选得到符合要求的差异基因进行GO功能注释和KEGG Pathway分析。

2  结果与分析

2.1  测序质量分析

利用Illumina HiSeqTM 6000进行测序，为了保证数据质量，在分析前对原始数据进行处理，去掉接头和低质量的序列，从表1可见，每个样品最后得到4000～7000万条Clean Data。从整体上看，Q20为97.34%～98.10%，Q30为92.77%～ 94.40%，GC含量为53.87%～55.77%，不确定碱基比例都为0。表明整体测序质量良好，数据可用于后续生物信息学分析。

2.2  样本关系分析

从图1中可知，相同处理测序样品间距离较近，不同处理及品种间样品基因表达水平存在明显差异，距离较远。根据重复性分析结果，相同处理样品间Pearson相关系数极高（>0.99）说明相同处理测序样品间重复性高，系统误差较小，结果可信度极高。

2.3  样品差异基因表达情况

对盐胁迫0、6、24 h后58M和58L品系幼穗的差异基因（differential-expressed genes，DEGs）根据FDR与log2FC的值进行筛选（筛选条件为FDR<0.05且|log2FC|>1），并进行统计分析发现，以0 h的幼穗为对照，58M品系在盐胁迫6 h后检测到表达量发生改变的基因为2568个，其中在盐胁迫响应中表达上调基因1483个，表达下调基因1085个;盐胁迫24 h后有1396个基因表达量发生了改变，其中有937个上调基因，459个下调基因（图2）。58L品系在盐胁迫6 h后有931个基因上调，2614个下调基因;盐胁迫24 h后有930个上调基因，1299个下调基因。将58M品系盐胁迫6 h的上调基因与58L品系盐胁迫6h后的下调基因对比后发现有178个共同基因，同样将盐胁迫24 h后58M上调基因与58L下调基因对比后发现有30个共同基因。

2.4  目标基因的GO功能富集分析

将得到的208个目标基因进行GO功能富集分析能够确定这些差异基因的主要生物学功能。根据不同的功能分为生物学过程、细胞组分和分子功能3个主类，分别占40.43%、31.56%和28.01%，由此可以看出大多数的差异基因与一些生物学功能具有显著的相关性。将目标基因进行GO功能注释分析，发现这些差异基因在参与生物学过程方面主要集中在细胞过程、代谢过程、单有机体过程等方面;在细胞组分中，差异基因参与的生物学功能主要包括细胞部分、细胞、细胞器等;在分子功能中，差异基因主要集中在催化活性、结合、转导活性和结构分子活性等方面（图3）。

2.5  目标基因的KEEG代谢途径富集分析

为了准确分析幼穗发育过程中体内响应盐胁迫代谢通路发生的变化，对目标差异基因进行KEGG分类统计分析，发现有35个基因得到注释，涉及32个Pathway（图4）。这些差异基因显著富集的通路，主要是二萜类生物合成（ko00904）、氨基酸糖与核苷酸糖代谢（ko00520）、苯丙烷生物合成（ko00940）、生物素代谢（ko00780）、代谢通路（ko01100）、次生代谢产物的生物合成（ko01110）、α-亚麻酸代谢（ko00592）、脂肪酸生物合成（ko00061）和不饱和脂肪酸的生物合成（ko01040）等。

2.6  目标基因转录因子分析

对目标差异基因中的转录因子进行了分析，并以0 h时的幼穗为对照，对盐胁迫6 h和24 h时转录因子在各品系幼穗中的表达量进行了统计分析。结果表明，在盐胁迫下的目标差异基因中有5个转录因子差异表达（表2）。其中NAC家族有2个、MYB家族2个、bHLH家族1个。盐胁迫下，这些转录因子在58M品系幼穗中短期内都呈现出显著上调的趋势，上调比例最高达273.55%，然而在58L品系幼穗中短期内其表达被抑制的效果明显，下调比例最高达到了73.68%。

3  讨论

植物響应逆境胁迫的调控机制十分复杂，当细胞感受到盐胁迫时，会将信号传递给相应的受体，继而控制与之相关基因表达和生理反应，同时在转录和翻译等水平作出应答[7]。当前对水稻幼穗在盐胁迫下耐盐机制的研究甚少，因此，对盐胁迫下水稻幼穗材料进行转录组水平测序分析，能够快速准确地筛选出幼穗中的耐盐以及耐盐相关基因的作用机制。本研究通过对耐盐材料58M和不耐盐材料58L盐处理前后的水稻幼穗进行测序，结果显示各项指标均符合要求，不确定碱基比例为0。表明整体测序质量良好。

在盐胁迫下水稻植株内相较于正常环境，会产生大量活性氧，从而导致膜脂过氧化加剧破坏细胞膜的生物学功能，严重时甚至会导致细胞死亡[8]。在长时间的进化与自然选择过程中，植物体内已经进化出能够适应不利生活环境的清除活性氧的系统，该系统主要由超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、过氧化物酶（peroxidase，POD）以及谷胱甘肽S转移酶（glutathione S-transferase，GST）等氧化还原酶和氧化还原类物质组成。研究发现，耐盐水稻比盐敏感水稻具有更强的清除活性氧能力，水稻叶片中的SOD、POD活性随着盐胁迫程度的增加呈现先上升后下降的趋势，在一定盐浓度范围内呈正相关趋势[9-10]。在烟草中过量表达NtGST/GPX基因，对增加烟叶在盐害环境中的抗逆性成效显著[11]。本研究通过对盐胁迫后的目标基因的分析后发现，在盐胁迫下，有3个编码过氧化物酶的基因和2个编码谷胱甘肽S转移酶的基因在58M幼穗体内表达量上调，在58L品系中下调。由此推测，导致58M具有较强耐盐性的原因，正是因为这些抗氧化酶在2个不同品系幼穗间的差异表达造成的。抗氧化系统的调节，可以有效清除对水稻有害的活性氧，保护水稻膜系统，维持正常膜结构与功能，增强在盐胁迫环境中的耐受性。

在植物的生长过程中，几乎所有的生命活动都受到激素的调控，其对盐胁迫的响应也不例外。激素在植物体内没有明显的专一性，通常一种激素可以对多个生理过程进行调控，同时也存在多种激素共同调节同一生理过程的作用[12]。在盐胁迫下的目标基因中发现，细胞分裂素合酶的基因在58M幼穗中上调，在58L中下调，推测细胞分裂素能够促进58M幼穗细胞的伸长生长，保证幼穗的正常发育，提高其在盐胁迫条件中的耐受性。

在逆境生物学研究中，植物体内钙信号一直是学者们重点关注的研究热点，其在植物逆境响应和生长发育过程调控中具有十分重要的意义[13]。当植物受到不利环境的胁迫时，钙离子下游的激酶，如钙依赖蛋白激酶（calcium-dependent protein kinases，CDPKs）、钙调素（calmodulin，CaM）和类钙调素蛋白（calmodulin-like proteins，CMLs）等会被诱导表达。本研究发现，在盐胁迫后的目标基因中，有1个CDPKs基因在58M幼穗中表达上调，在58L中表达下调;因此，推测在幼穗响应盐胁迫过程中钙信号占据一定的地位，可能参与激活细胞内的各种解毒相关基因。

植物体内ABC转运蛋白（ATP-binding cassette transporter，ABC transporter）在调节气孔功能、运输生长素以及脂质降解等方面中有着至关重要的作用[14]。研究发现，ABC转运蛋白在拟南芥体内过量表达，能够增强其抗干旱、抗盐等非生物胁迫的能力[15]。本研究发现，在目标基因中存在1个ABC转运蛋白基因在58M中表达上调，58L中表达下调，说明在幼穗响应盐胁迫过程中ABC转运蛋白可能具有一定的作用。当前，对于ABC转运体在植物应对逆境胁迫响应的研究还相对较少，因此，加大对盐胁迫下ABC转运体运输机制和相关目的基因的研究，可能可以发现新的耐盐机制或耐盐相关基因，增加人们对耐盐机理的认识。

众多研究表明，转录因子在植物对逆境胁迫的应答过程中发挥重要的作用。目前已经鉴定得到与耐盐相关转录因子家族包括 MYB、NAC、WRKY、AP2、ERF、bHLH、bZIP、C2H2等[16]，在植物体内某些特定转录因子表达量的变化能极大影响其适应逆境的能力。NAC家族转录因子与植物对逆境胁迫的应答反应有着密切的联系[17-18]。在盐胁迫下，将水稻ONAC063基因转化拟南芥发现，过量表达该基因能够提高植株的耐盐性。基因表达谱分析后发现，ONAC063基因过量表达后，能够诱导其他耐盐相关基因的表达，如淀粉酶基因AMY1[19]。MYB家族转录因子是对植物体内存在对逆境响应反应数量及功能最多的转录因子家族之一，其在逆境胁迫中的调控具有十分关键的作用[20-21]。研究发现，MYB20属于MYB家族成员之一，其编码基因AtMYB20能够通过抑制PP2Cs表达来增强抗盐性[22]。通过调控与应激反应相关基因的表达，TaMYB73增强了拟南芥在盐分胁迫下的耐盐性[23]。经过盐处理后，水稻幼穗中部分转录因子的表达量发生变化，且在不同品系中表达趋势存在明显的差别，说明一些转录因子在参与幼穗响应盐胁迫过程中可能具有重要的功能。

4  结论

本研究采用浓度为0.6%的NaCl对幼穗进行盐胁迫，并利用RNA-seq技术对处理前后的幼穗材料进行测序。通过对比不同品系、不同时刻盐胁迫条件下的上调基因与下调基因的韦恩图发现，有208个差异基因受到盐胁迫时在58M品系幼穗体内上调，在58L品系中下调，其中在盐胁迫6 h时有178个，盐胁迫24 h时有30个。将这些目标基因通过GO功能富集分析与KEGG pathway，明确了差异基因富集途径以及分子功能。同时这些目标差异基因中转录因子进行了分析，发现了5个重要的转录因子，其主要涉及NAC家族、MYB家族以及bHLH家族。这些基因能够作为幼穗耐盐研究中的功能基因，该研究为进一步探讨幼穗耐盐分子机制和挖掘耐盐关键基因提供了理论依据。

参考文献

[1] 李  彬， 王志春， 孫志高， 等. 中国盐碱地资源与可持续利用研究[J]. 干旱地区农业研究， 2005， 23（2）： 154-158.

[2] 刘小京， 刘孟雨. 盐生植物利用与区域农业可持续发展[M]. 北京： 气象出版社， 2002.

[3] 孙明法， 严国红， 王爱民， 等. 水稻耐盐育种研究进展[J]. 大麦与谷类科学， 2017， 34（4）： 1-9.

[4] 胡时开， 陶红剑， 钱  前， 等. 水稻耐盐性的遗传和分子育种的研究进展[J]. 分子植物育种， 2010， 8（4）： 629-640.

[5] 成勤勤. 关于水稻幼穗分化发育的研究[D]. 扬州： 扬州大学， 2006.

[6] 赵长华， 丁艳锋. 水稻穗粒数形成的生理生化研究进展[J]. 耕作与栽培， 2001（1）： 5-9.

[7] 卢  锐， 李培英. 偃麦草盐胁迫下转录组分析[J]. 草地学报， 2020， 28（1）： 31-44.

[8] 黄  洁， 白志刚， 钟  楚， 等. 水稻耐盐生理及分子调节机制[J]. 核农学报， 2020， 34（6）： 1359-1367.

[9] 徐  晨， 凌风楼， 徐克章， 等. 盐胁迫对不同水稻品种光合特性和生理生化特性的影响[J]. 中国水稻科学， 2013， 27（3）： 280-286.

[10] 荆培培， 崔  敏， 秦  涛， 等. 土培条件下不同盐分梯度对水稻产量及其生理特性的影响[J]. 中国稻米， 2017， 23（4）： 26-33.

[11] Roxas V P， Lodhi S A， Garrett D K， et al. Stress tolerance in transgenic tobacco seedlings that overexpress glutathione S-transferase/glutathione peroxidase[J]. Plant and Cell Phy-siology， 2000， 41（11）： 1229-1234.

[12] Munns R， Tester M. Mechanisms of salinity tolerance[J]. Annual Review of Plant Biology， 2008， 59： 651-681.

[13] Asano T， Hakata M， Nakamura H， et al. Functional characterisation of OsCPK21， a calcium-dependent protein kinase that confers salt tolerance in rice[J]. Plant Molecular Biology， 2011， 75（1/2）： 179-191.

[14] Kretzschmar T， Burla B， Lee Y， et al. Functions of ABC transporters in plants[J]. Essays in Biochemistry， 2011， 50（1）： 145-160.

[15] Kim D Y， Jin J Y， Alejandro S， et al. Overexpression of AtABCG36 improves drought and salt stress resistance in Arabidopsis[J]. Physiologia Plantarum， 2010， 139（2）： 170-180.

[16] 宋雪梅， 杨九艳， 吕美婷， 等. 红砂种子萌发对盐胁迫及适度干旱的响应[J]. 中国沙漠， 2012， 32（6）： 1674-1680.

[17] Puranik S， Sahu P P， Srivastava P S， et al. NAC proteins： regulation and role in stress tolerance[J]. Trends in Plant Science， 2012， 17（6）： 369-381.

[18] Nakashima K， Takasaki H， Mizoi J， et al. NAC transcription factors in plant abiotic stress responses[J]. Biochimica et Biophysica Acta， 2012， 1819（2）： 97-103.

[19] Yokotani N， Ichikawa T， Kondou Y， et al. Tolerance to various environmental stresses conferred by the salt-respo-n?sive rice gene ONAC063 in transgenic Arabidopsis[J]. Planta， 2009， 229（5）： 1065-1075.

[20] 刘  蕾， 杜  海， 唐晓凤， 等. MYB 转录因子在植物抗逆胁迫中的作用及其分子机理[J]. 遗传， 2008， 30（10）： 1265-1271.

[21] Dubos C， Stracke R， Grotewold E， et al. MYB transcription factors in Arabidopsis[J]. Trends in Plant Science， 2010， 15（10）： 573-581.

[22] Cui M H， Yoo K S， Hyoung S， et al. An Arabidopsis R2R3-MYB transcription factor， AtMYB20， negatively re-gulates type 2C serine/threonine protein phosphatases to enhance salt tolerance[J]. FEBS Letters， 2013， 587（12）： 1773-1778.

[23] He Y， Li W， Lv J， et al. Ectopic expression of a wheat MYB transcription factor gene， TaMYB73， improves salinity stress tolerance in Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Experimental Botany， 2012， 63（3）： 1511-1522.

責任编辑：崔丽虹