BECN1、性别决定区Y盒转录因子9表达与甲状腺癌患者临床特征及预后的关系研究

陈亚柯，徐青青，孙宁，宋洋，邱新光，陈建民

1郑州大学第一附属医院甲状腺二/疝和腹壁外科，郑州 450052

2郑州大学第五附属医院保育中心，郑州 450000

甲状腺癌是临床常见的内分泌恶性肿瘤，约占全身恶性肿瘤的1%，其发病与地区、种族、性别等诸多因素密切相关，如今全球内甲状腺癌发病率呈明显上升趋势，严重威胁患者身心健康。甲状腺癌根治术是临床常用治疗手段，大部分患者预后良好，总体生存率较高，但有少数患者预后较差。甲状腺癌术后患者生存时间的影响因素较为复杂，但临床研究认为，甲状腺癌细胞黏附性、侵袭转移能力与肿瘤转移、术后复发等密切相关，但具体作用机制仍有待研究。性别决定区Y盒转录因子 9（sex determining region Y-box transcription factor 9，SOX9）与细胞增殖、分化、迁移等过程均存在联系。研究证实，SOX9在乳腺癌组织中呈阳性表达，且明显高于癌旁组织，能够参与肿瘤发生过程。BECN1是一种抑癌基因，其表达能够促进肿瘤细胞的降解，抑制肿瘤细胞过度增殖，在肿瘤发生、发展中发挥重要作用。理想的免疫学或基因学标志物对甲状腺癌的早期诊疗、疗效及预后评估十分关键，基于既往研究及上述理论，本研究回顾性探讨BECN1、SOX9在甲状腺癌组织中的表达及与患者临床特征、预后的关系，以期为甲状腺癌的临床诊疗及预后评估提供理论参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2014年1月至2017年1月郑州大学第一附属医院收治的甲状腺癌患者的病历资料。纳入标准：经临床病理检查证实为甲状腺癌；均经甲状腺癌根治术治疗；术前甲状腺功能正常；术后未接受放化疗；病历资料及随访资料完整。排除标准：合并其他恶性肿瘤；放射线暴露史；自身免疫疾病及全身疾病；血液系统疾病；严重躯体性疾病；合并心脏病、糖尿病、冠心病等严重内科疾病；器质性功能不全或障碍；生存时间不足半年；精神疾病；未完成随访。根据纳入、排除标准，共纳入106例甲状腺癌患者，取其甲状腺癌组织及癌旁组织。

1.2 方法

1.2.1 检测方法 术中获得甲状腺癌组织及癌旁组织，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，采用SP免疫组织化学染色法检测BECN1、SOX9表达情况，组织切片常规脱蜡水化，临用前常规63℃烤炉烤1 h，二甲苯、无水乙醇以及80%～90%乙醇浸泡，以封闭内源性过氧化物酶活性。微波枸橼酸盐抗原修复，降至室温后磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）洗3次，每次5 min，滴加阻断剂，置于室温下15 min。加一抗（工作浓度1∶600）4℃孵育24 h，PBS洗3次，每次1 min；滴加生物素标记的二抗，室温孵育30 min，PBS洗3次，每次3 min；滴加SP试剂并于37℃孵育1 h，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，苏木素复染、脱水、干燥、中性树脂封片。用PBS代替一抗作为阴性对照。

阳性标准：根据染色强度及阳性细胞百分比进行半定量分析，每张免疫组化切片随机选择5～10个具有代表性的高倍视野进行评估。染色强度：无染色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，黄褐色为3分；阳性细胞百分比：＜5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，＞50%为3分。上述两项积分相加，0～3分为阴性，≥4分阳性。

1.2.2 研究方法 比较甲状腺癌组织及癌旁组织中BECN1、SOX9表达情况，依据患者入院建立的档案，收集患者年龄、肿瘤大小、临床分期、分化程度、淋巴结转移等临床特征，并比较分析甲状腺癌组织中BECN1、SOX9表达与患者临床特征的关系。

1.2.3 随访 术后进行为期3年的随访，每3个月进行1次，采用门诊随访、电话随访或走访等形式，具体包括常规体格检查、实验室生化指标检测、影像学检查等，随访截止时间为2020年1月，记录所有患者生存时间。采用多因素Logistic回归模型分析甲状腺癌患者预后影响因素。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 BECN1、SOX9表达情况的比较

BECN1、SOX9阳性均主要定位于细胞质中。甲状腺癌组织中SOX9阳性表达率明显高于癌旁组织，BECN1阳性表达率明显低于癌旁组织，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

表1 甲状腺癌组织及癌旁组织中BECN1、SOX9表达情况的比较[n（%）]

2.2 不同临床特征甲状腺癌患者的甲状腺癌组织中BECN1、SOX9表达情况的比较

不同年龄、病理类型、肿瘤大小甲状腺癌患者甲状腺癌组织中BECN1、SOX9阳性表达率比较，差异均无统计学意义（

P

＞0.05）；Ⅰ～Ⅱ期、高分化、无淋巴结转移甲状腺癌患者甲状腺癌组织中BECN1阳性表达率分别高于Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、有淋巴结转移患者，差异均有统计学意义（

χ

=15.914、21.626、6.052，

P

＜0.05）；Ⅰ～Ⅱ期、高分化、无淋巴结转移甲状腺癌患者甲状腺癌组织中SOX9阳性表达率分别明显低于Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、有淋巴结转移患者，差异均有统计学意义（

χ

=19.650、13.423、19.501，

P

＜0.01）。（表2）

表2 不同临床特征甲状腺癌患者的甲状腺癌组织中BECN1、SOX9的表达情况（n=106）

2.3 不同BECN1、SOX9表达情况甲状腺癌患者生存情况的比较

BECN1阳性表达患者的平均生存时间为（35.26±8.39）个月，明显长于阴性表达患者的（30.16±7.35）个月，差异有统计学意义（

t

=4.707，

P

=0.000）；SOX9阳性表达患者的平均生存时间为（31.20±8.03）个月，明显短于阴性表达患者的（35.74±6.99）个月，差异有统计学意义（

t

=4.391，

P

=0.000）。

2.4 甲状腺癌患者预后影响因素的单因素分析

不同年龄、病理类型甲状腺癌患者3年生存率比较，差异均无统计学意义（

P

＞0.05）；不同临床分期、肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移状态、BECN1及SOX9表达情况的甲状腺癌患者3年生存率比较，差异均有统计学意义（

P

＜0.05）。（表3）

表3 甲状腺癌患者预后影响因素的单因素分析（n=106）

2.5 甲状腺癌患者预后影响因素的多因素Logistic回归分析

将表3中差异有统计学意义的分化程度、淋巴结转移情况、BECN1表达情况、SOX9表达情况作为自变量，患者预后作为因变量（生存=0，死亡=1）纳入多因素Logistic回归模型，结果显示，淋巴结转移、分化程度、BECN1表达及SOX9表达均是甲状腺癌患者预后的影响因素（

P

＜0.05）。（表4）

表4 甲状腺癌患者预后影响因素的多因素Logistic回归分析

3 讨论

甲状腺癌发病隐匿，患者早期无典型临床特征，确诊时肿瘤已发生转移，临床疗效较差，因此甲状腺癌的早期、准确诊疗对于疗效、患者预后均十分关键。肿瘤标志物的选择是临床检测的研究热点问题，病理组织活检是临床诊断及评估疾病的金标准，但该方式对机体创伤较大，易使病情恶化。常规影像学检查可能对机体产生放射性损伤，且无法确诊肿瘤。免疫治疗或基因靶向治疗在恶性肿瘤的辅助治疗过程中发挥了重要作用，但关于甲状腺癌靶向治疗的研究仍然不足，临床尚缺乏甲状腺癌可靠、有效的免疫或基因治疗靶点。本研究探讨了肿瘤细胞基因调控靶基因及相关蛋白信号通路的变化，以期为甲状腺癌的发病机制及临床诊疗提供理论参考。

BECN1是一种抑癌基因，是首次被发现参与自噬过程的基因，而适度的自噬过程能够帮助细胞存活，过度自噬则会导致细胞自噬性凋亡。BECN1蛋白在细胞自噬过程中发挥重要作用，研究指出，肺癌、卵巢癌、脑癌等恶性肿瘤中BECN1呈明显低表达，而在肝癌、胃癌中呈明显高表达，由此可见，BECN1蛋白在不同肿瘤细胞中发挥作用不同。本研究显示，BECN1阳性主要定位于细胞质中，甲状腺癌组织中BECN1阳性表达率明显低于癌旁组织，说明BECN1在甲状腺癌中呈低表达，且与甲状腺癌的发生、发展相关，BECN1表达下调，细胞的自噬反应降低，无法诱导自噬性肿瘤细胞死亡，从而促进肿瘤发生发展；BECN1对肿瘤细胞的凋亡具有促进作用，能够抑制肿瘤生长；BECN1还可通过影响血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和缺氧诱导因子-2α（hypoxiainducible factor-2α，HIF-2α）抑制血管内皮的增殖、迁移及血管肿瘤新生，阻止肿瘤进展。

SOX9能够与其他转录因子相互作用而调控靶基因表达，其异常表达与多种恶性肿瘤发生、发展密切相关。由于器官及组织的不同，SOX9发挥的作用亦不相同，既能作为致癌基因，又能作为抑癌基因，但SOX9在多数肿瘤中均会发挥致癌基因作用。研究指出，膀胱癌、大肠癌等恶性肿瘤中SOX9呈上调表达，发挥促进肿瘤细胞增殖、迁移的作用；在肺癌、胃癌等组织中，SOX9表达水平明显上调，其表达水平与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、临床分期等密切相关。本研究结果中，SOX9阳性主要定位于细胞质中。甲状腺癌组织中SOX9阳性表达率明显高于癌旁组织，说明SOX9能够参与甲状腺癌的发生过程，发挥致癌基因作用。SOX9在甲状腺癌细胞中呈高表达并促进肿瘤细胞的增殖、侵袭，因此推断敲除SOX9能够有效抑制甲状腺癌细胞的增殖。

本研究进一步探讨了甲状腺癌临床特征与BECN1、SOX9表达的关系，结果显示，Ⅰ～Ⅱ期、高分化、无淋巴结转移的甲状腺癌患者甲状腺癌组织中BECN1阳性表达率分别高于Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、有淋巴结转移患者，SOX9阳性表达率分别明显低于Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、有淋巴结转移患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。说明BECN1、SOX9表达与甲状腺癌患者的临床分期、肿瘤分化程度及淋巴结转移状态密切相关，随着甲状腺癌疾病的进展，BECN1阳性表达率逐渐降低，SOX9阳性表达率逐渐升高，两者均能够参与甲状腺癌的发生、发展过程，并作为甲状腺癌恶性程度评估的重要辅助指标。

本研究还探讨了BECN1、SOX9表达与甲状腺癌患者预后的关系，结果显示，BECN1阳性表达患者的平均生存时间为（35.26±8.39）个月，明显长于阴性表达患者的（30.16±7.35）个月，SOX9阳性表达患者的平均生存时间为（31.20±8.03）个月，明显短于阴性表达患者的（35.74±6.99）个月。提示BECN1低表达、SOX9高表达的甲状腺癌患者预后较差，BECN1阴性表达或SOX9阳性表达患者大多进展至疾病晚期，且存在淋巴结转移、肿瘤分化程度较低，因此预后更差。进一步采用多因素Logistic回归模型分析甲状腺癌的预后影响因素，结果表明，淋巴结转移、分化程度、BECN1表达及SOX9表达均是甲状腺癌预后的影响因素，提示BECN1及SOX9表达与甲状腺癌预后密切相关，在预测肿瘤转移及患者预后方面具有一定临床价值。

综上所述，甲状腺癌组织中BECN1阳性表达率较低，SOX9阳性表达率较高，且二者表达均与临床分期、肿瘤分化程度及淋巴结转移状态有关；BECN1、SOX9表达与甲状腺癌患者预后有关，能够作为评估肿瘤恶性程度的重要指标，预测患者预后。