艾迪注射液对人胃癌HGC-27细胞的抗肿瘤作用机制研究△

陈溪雯，钱亚云

扬州大学医学院（扬州大学转化医学研究院）/国家中医药管理局胃癌毒邪论治重点研究室，江苏 扬州 225001

胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，腺癌是其中最常见的病理类型。早期胃癌多无特殊症状，易被患者忽视，多数患者确诊时已处于晚期，错过了最佳的手术治疗时机，只能选择放化疗。化疗药物对肿瘤细胞无选择特异性，在杀死肿瘤细胞的同时，也会影响正常细胞的功能，不良反应明显，增加了患者的身心负担。

从中药中寻找抗肿瘤活性成分逐渐受到临床的重视，也是将传统医学与现代科学相结合的重要方式。临床研究及基础实验表明，艾迪注射液在提高机体免疫力、抗肿瘤治疗等方面的效果较好。

雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）信号转导通路在生理和病理条件下对细胞生长等多个方面均发挥至关重要的作用，能够对多种肿瘤细胞进行修饰，包括增殖、分化、运动性和细胞内运输等，使肿瘤细胞对抗肿瘤疗法产生抗性。MTOR通路的异常激活可调节肿瘤细胞的自噬、凋亡、转移、上皮-间充质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）等方面，对艾迪注射液可能的分子机制进行探讨有重要意义。

人胃癌HGC-27细胞源自未分化的胃癌组织，与其他分化程度的胃癌细胞相比，人胃癌HGC-27细胞恶性程度较高，未分化胃癌患者的预后差，这与艾迪注射液临床适用条件相符。本文探讨不同浓度的艾迪注射液对HGC-27细胞增殖和迁移能力的影响及其可能相关的信号通路，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器

野生型人胃癌HGC-27细胞购自中国科学院研究所上海细胞库。艾迪注射液购自贵州益佰制药股份有限公司，注射用顺铂购自齐鲁制药有限公司。兔抗人单克隆抗体β-actin、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）、MTOR、真核翻译起始因子4E结合蛋白1（eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1，4EBP1）、磷酸化的4EBP1（phospho-4EBP1，p-4EBP1）均购自美国 Cell Signaling公司，兔抗免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）购自美国ABclonal公司，胎牛血清购自美国Hyclone公司，RPMI-1640培养基购自北京索莱宝公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒购自美国Biosharp公司，噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）购自美国Corning公司，二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）购自生工生物工程（上海）股份有限公司。无菌6孔细胞培养板、无菌96孔细胞培养板均购自美国Costar公司；恒温培养箱、酶标仪、台式离心机均购自美国Thermo公司，蛋白电泳槽、全自动多功能酶标仪、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝胶成像分析仪均购自美国Bio-Rad公司，逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）仪购自瑞士Roch公司，倒置显微镜购自日本Olympus公司，制冰机购自德国Scotsman公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养细胞，并置于5% CO、37℃的无菌恒温培养箱内培养，每天观察细胞状态并及时更换培养液，将细胞培养至对数生长期，采用胰酶细胞消化液将细胞消化进行后续实验。

1.2.2 MTT 法检测细胞增殖能力 取对数生长期的人胃癌HGC-27细胞，调整细胞浓度为5×10/孔，接种于96孔板，采用RPMI 1640培养基培养12 h后，弃上清。分别加入 0、7.5、15.0、30.0、60.0、120.0 mg/ml艾迪注射液的RPMI 1640培养基100 μl，分别作用24、48、72 h后，每孔加入0.5%的MTT溶液20 μl，37℃继续培养4 h后，弃上清。每孔加入150.0 μl的DMSO，低速振荡10 min，采用多功能酶标仪于490 nm处测量各孔吸光度（A）。

1.2.3 划痕实验检测细胞迁移能力 取对数生长期的人胃癌HGC-27细胞接种于6孔板，待细胞铺满后，于每孔中线处划痕，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）冲洗3次，洗去漂浮细胞，倒置显微镜下观察刮痕内无细胞。0、7.5、15.0、30.0、60.0、120.0 mg/ml艾迪注射液培养人胃癌HGC-27细胞48 h后，半数抑制浓度（50% concentration of inhibition，IC）为 20.17 mg/ml。后续实验将6.0、12.0、24.0 mg/ml艾迪注射液处理的人胃癌HGC-27细胞分别设置为低浓度组、中浓度组、高浓度组，以野生型HGC-27细胞作为空白对照组，2.0 mg/L顺铂处理的人胃癌HGC-27细胞作为阳性对照组，每组设3个复孔。继续培养24 h后，于倒置相差显微镜下拍照记录各孔划痕的距离。细胞迁移率（%）=100%-未迁移率，未迁移率（%）=培养24 h空白面积/培养0 h空白面积×100%。

1.2.4 蛋白质印迹法（Western blot）检测AKT、MTOR、4EBP1、p-4EBP1蛋白的相对表达量 取对数生长期低浓度组（6.0 mg/ml）、中浓度组（12.0 mg/ml）、高浓度组（24.0 mg/ml）人胃癌HGC-27细胞，以及空白对照组和阳性对照组人胃癌HGC-27细胞，调整细胞浓度为5×10/孔，接种于6孔板内，培养48 h后，提取细胞总蛋白，BCA法测定浓度。经过SDSPAGE电泳，转膜90 min，采用含5%脱脂奶粉的TBST封闭2 h，加入一抗（浓度为1∶1000），4 ℃孵育过夜。TBST清洗3遍，加入二抗（浓度为1∶2000），室温孵育2 h，TBST清洗3遍，电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）法采集并分析图像，计算AKT、MTOR、4EBP1、p-4EBP1蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 细胞增殖能力的比较

随艾迪注射液浓度的升高，培养24、48、72 h，人胃癌HGC-27细胞A值均逐渐降低，差异均有统计学意义（

P

＜0.05）；但60.0 mg/ml与120.0 mg/ml艾迪注射液处理的人胃癌HGC-27细胞培养48、72 h时A值比较，差异均无统计学意义（

P

＞0.05）。（表 1）

表1 不同浓度艾迪注射液处理的人胃癌HGC-27细胞培养不同时间的A值比较（±s）

2.2 细胞迁移能力的比较

培养24 h，低浓度组、中浓度组、高浓度组人胃癌HGC-27细胞未迁移率均高于空白对照组，差异均有统计学意义（

P

＜0.05）。高浓度组人胃癌HGC-27细胞未迁移率均高于低浓度组和中浓度组，差异均有统计学意义（

P

＜0.05），但低浓度组与中浓度组人胃癌HGC-27细胞未迁移率比较，差异无统计学意义（

P

＞0.05）。阳性对照组人胃癌HGC-27细胞未迁移率高于空白对照组，但低于中浓度组和高浓度组细胞，差异均有统计学意义（

P

＜0.05）。（表2）

表2 不同组别人胃癌HGC-27细胞未迁移率比较（%，±s）

2.3 AKT、MTOR、4EBP1、p-4EBP1蛋白相对表达量比较

低浓度组和中浓度组人胃癌HGC-27细胞AKT、4EBP1、p-4EBP1蛋白相对表达量均低于空白对照组，且中浓度组人胃癌HGC-27细胞MTOR蛋白的相对表达量低于空白对照组，差异均有统计学意义（

P

＜0.05）。高浓度组人胃癌HGC-27细胞AKT、MTOR、4EBP1、p-4EBP1蛋白相对表达量均低于低浓度组和中浓度组，中浓度组人胃癌HGC-27细胞AKT蛋白的相对表达量高于低浓度组，差异均有统计学意义（

P

＜0.05），但低浓度组和中浓度组人胃癌HGC-27细胞MTOR、4EBP1、p-4EBP1蛋白相对表达量比较，差异均无统计学意义（

P

＞0.05）。（表3）

表3 不同组别人胃癌HGC-27细胞中AKT、MTOR、4EBP1、p-4EBP1蛋白相对表达量的比较（±s）

3 讨论

胃癌的发病率、转移率和病死率均较高，早期诊断率较低，根治性切除率和患者5年生存率也均较低。中医药是恶性肿瘤综合治疗的重要部分，主要目的是稳定瘤体，改善患者的临床症状、延长生存期、提高生活质量。艾迪注射液是常用的纯中药复方制剂，其主要成分中的人参、黄芪、斑蝥、刺五加有广泛的生物活性。李瑞青采用艾迪注射液联合化疗治疗62例老年晚期胃癌，结果显示，与单纯化疗相比，中药联合化疗能够明显缓解患者的癌因性疲乏程度，提高生活质量，延长生存期。刘沙河系统评价了艾迪注射液对缓解化疗不良反应的作用，结果显示，艾迪注射液能有效减少化疗患者白细胞计数和血小板计数降低的风险，减少外周神经毒性反应，减少消化道不良反应。

本研究结果显示，不同浓度的艾迪注射液处理人胃癌HGC-27细胞24、48、72 h后，细胞的增殖能力受到明显抑制，呈现出浓度与时间的依赖性，表明艾迪注射液可明显抑制HGC-27细胞的生长能力。艾迪注射液的主要成分为斑蝥，对正常细胞有一定毒性，因此，后续实验中分别设置低浓度组、中浓度组、高浓度组，并研究其作用机制，希望在毒性较低的情况下，发挥最佳的抗肿瘤作用。划痕实验结果显示，与空白对照组细胞相比，艾迪注射液处理的人胃癌HGC-27细胞向空白处迁移的能力受到明显抑制，表明艾迪注射液可能通过抑制胃癌细胞的迁移发挥抗肿瘤作用。

斑蝥是艾迪注射液的主要抗肿瘤成分，为加强斑蝥的抗肿瘤效果，减少毒性，又添加了益气、活血的人参、黄芪、刺五加。艾迪注射液作为抗肿瘤药物的分子机制尚未探明，但已有针对其成分的基础实验研究。陈慕媛等研究发现，去甲斑蝥酸钠处理胰腺癌PANC-1细胞后，p-PI3K和p-AKT蛋白的表达均下调，提示去甲斑蝥酸钠可能通过调节PI3K/AKT通路，下调B细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）蛋白的表达，上调Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein，BAX）和caspase 3蛋白的表达。陈佳欣等研究发现，人参皂苷Compound K（CK）能够抑制人肝癌细胞BEL-7404的增殖，诱导细胞自噬，下调AKT/MTOR通路相关蛋白AKT、p-AKT、MTOR、p-MTOR的表达，表明人参皂苷CK可以通过调控AKT/MTOR信号通路诱导人肝癌细胞BEL-7404的自噬。

MTOR信号转导通路是一条酪氨酸激酶级联信号通路，是细胞生存通路之一。AKT是磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）下游的主要分子，活化的AKT能够磷酸化下游的多种蛋白，如核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、MTOR和p21基因等来介导细胞生长、增殖、细胞周期和糖代谢。MTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，由MTORC1和MTORC2两种多蛋白复合物构成。MTORC1的主要功能是通过激活和磷酸化下游分子4EBP1来调节蛋白质合成和细胞生长。AGC激酶由cAMP依赖的蛋白激酶（cAMP-dependent protein kinase，PKA）、cGMP依赖的蛋白激酶（cGMP-dependent protein kinase，PKG）和磷脂依赖的蛋白激酶C（phospholipid-dependent protein kinase C，PKC）组成。研究表明，MTORC2能够磷酸化AGC激酶家族中AKT的C端疏水模体，对生长因子信号作出响应。两种复合物相互调节，从而促进蛋白合成、生长因子信号转导，促进细胞生长和迁移。

为进一步研究艾迪注射液的抗肿瘤作用机制，本研究观察了MTOR信号通路在其中的作用，结果显示，不同浓度艾迪注射液处理后的HGC-27细胞中AKT、MTOR、4EBP1、p-4EBP1蛋白相对表达量明显降低。表明艾迪注射液可能通过抑制MTOR信号通路活化，发挥抗肿瘤作用。

综上所述，艾迪注射液可能通过抑制AKT、MTOR、4EBP1、p-4EBP1等MTOR信号通路相关蛋白而发挥抗肿瘤作用。但肿瘤细胞的作用机制较为复杂，艾迪注射液是否还通过其他途径发挥抗肿瘤作用，尚有待后续研究。