液体活检在食管鳞状细胞癌中的应用及展望△

努尔斯曼古丽·买买提明，张莉

新疆医科大学第一附属医院综合内一科，乌鲁木齐 830054

食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，是全球第八大常见恶性肿瘤及第六大常见恶性肿瘤死亡原因，每年有超过45.6万新发病例及40万死亡病例，目前患者的5年生存率约为20%。食管癌常见的病理类型包括鳞状细胞癌和腺癌，其中鳞状细胞癌占食管癌的90%。目前，食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）的具体发病原因仍未完全阐明，目前的研究显示其发生与遗传、生活和饮食习惯以及慢性损伤等因素均有关，是影响人类健康的一大杀手。ESCC起源于食管黏膜上皮，是常见的消化道恶性肿瘤之一，也是一种生长迅速、淋巴结转移率高的侵袭性恶性肿瘤，多在70岁左右时发病，且男性多见，男女比例为2.5∶1。ESCC因起病隐匿、缺乏特异性导致其早期诊断困难，当患者出现进行性吞咽困难、体重下降等症状而就诊时常为中晚期，且因食管内有丰富的淋巴脉管网络，导致早期行根治性手术治疗后仍有部分患者出现复发及远处转移。近年来的研究表明，从肿瘤组织脱落进入淋巴脉管系统的循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）可导致肿瘤复发及转移，因此导致患者预后差、病死率高。目前常用的食管癌治疗方法包括手术、局部放疗、全身化疗、靶向治疗、免疫治疗等，但这些治疗效果仍不理想，患者术后及放化疗后易出现复发及转移。同时，复发转移后可选择的治疗方案有限，从而导致进展性ESCC的治疗成为临床上的一大难题。对于ESCC患者，如果能够早期诊断并接受治疗可大大提高患者的生存率。因此，寻找一种更敏感、安全且能够早期反映肿瘤进展的方法成为ESCC诊断和治疗的关键。相关研究结果证实，检测循环肿瘤标志物是解决该难题的一个有效方案。肿瘤在发生、发展过程中需要通过血液获取营养物质，坏死、凋亡后的代谢产物也会释放入血从而排出体内，因此血液是病灶组织以外的最理想检测标本，CTC、循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循环肿瘤RNA（circulating tumor RNA，ctRNA）及肿瘤代谢产物中筛选的分子生物标志物已经在一些恶性肿瘤的诊断和治疗中发挥了一定的作用。基于血液的液体活检是一种低创检查，可通过检测血液中的循环标志物获取与原发灶疾病相关的信息，并动态观察疾病的演变过程。本文围绕液体活检技术在ESCC中的最新研究进展作一综述，同时探讨循环肿瘤标志物在ESCC诊断、治疗及预后判断中的作用及局限性。

1 液体活检

液体活检是通过检测人体不同体液（包括血液、尿液、粪便、唾液或脑脊液等）中肿瘤相关生物标志物来获取疾病相关信息的方法，最常用的体液为血液，通过检测血液中从原发性或转移性肿瘤病灶脱落的肿瘤细胞、DNA、RNA等，可识别肿瘤相关突变的存在并获得疾病最初治疗前后、复发和演变的信息。与传统活检相比，液体活检是通过非侵入性的方式检测患者血液中的DNA、RNA或蛋白质，可在疾病不同阶段连续进行，易被患者接受，可以动态监测疾病变化情况并根据结果实时调整治疗方案及判断预后。

2 循环肿瘤标志物

循环肿瘤标志物包括从原发灶及转移灶脱落入血的单个肿瘤细胞凋亡或肿瘤组织坏死释放入血的DNA或RNA、外泌体、肿瘤相关血小板（tumor-educated blood platelet，TEP）、循环肿瘤相关微粒等，这些不同的生物标志物均携带与原发肿瘤相关的遗传及变异等信息，在肿瘤的诊断和治疗中发挥重要作用。

2.1 CTC

CTC来源于肿瘤组织，原位肿瘤细胞通过上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）并侵入血液循环从而形成CTC。1869年，Thomas在1例转移性恶性肿瘤患者的血液中发现了CTC。肿瘤细胞发生EMT后，细胞黏附分子表达减少，获得间充质细胞表型，细胞的运动能力增强，从而促进肿瘤细胞的侵袭和播散，导致肿瘤的早期转移和复发。Lianidou等研究表明，CTC可作为多种实体瘤的生物标志物，与实体瘤的早期诊断、预后及治疗相关。目前CTC主要通过基于物理学特征及免疫学特征的方法进行分离及富集，由于具有富集纯度高以及能够保持细胞活性等优势，免疫学富集方法相较于传统物理学富集方法应用更为广泛。Li等采用免疫磁珠分离法（magnetic activated cell sorting，MACS）检测ESCC患者血液中的CTC，发现140例ESCC患者中，62例（44.3%）患者检测到CTC，且CTC数量与ESCC患者的临床分期有关（P=0.013），提示CTC阳性是ESCC患者的独立预后生物标志物。Han等通过优化的CanPatrolCTC分型检测系统分析21例ESCC患者的血液样本，共检测到129个CTC，结果发现CTC数量与患者的TNM分期有关。Han等采用上皮肿瘤细胞大小分离法（isolation by size of epithelial tumor cell，ISET）测定60例ESCC患者治疗前的CTC，结果提示患者的无进展生存期（progression-free survival，PFS）与CTC数量呈负相关，多因素分析结果显示，CTC值＞2是肿瘤复发的独立预后指标。临床上检测、计数和分离CTC的潜在应用价值可能包括监测复发或判断预后，实时监测治疗效果。

CTC是完整、有活性的细胞，包含肿瘤的全基因组、蛋白质组等信息，是研究肿瘤组织信息的丰富来源，通过检测CTC有助于早期发现肿瘤侵袭相关基因特征。通常情况下，进入血液的CTC会在短期内被免疫细胞杀伤，只有具有高度转移潜能的CTC才可以通过免疫逃逸存活下来。通过分离血液中的这些CTC并应用高通量测序技术（next generation sequencing，NGS）获取CTC的基因组学及蛋白质组学信息，通过生物信息学分析肿瘤发生侵袭转移的代谢途径和信号通路，可能为肿瘤的治疗提供潜在靶点。

虽然CTC在ESCC的诊疗中具有很大的应用前景，但是其在临床中的可行性仍面临挑战，主要是由于CTC的检出率低、特异性低、个体差异大、费用高，在应用标准方案收集血液样本保证质量一致的前提下，加工前后及过程中仍有可能导致细胞损伤，使得CTC的分离成为一大难题。此外，对单个CTC进行基因组学及蛋白质组学研究对技术及人员的要求较高，且耗费大，在临床上的应用受到一定的限制。因此，需要继续探索简单、可靠的方法提高CTC的检出率。

2.2 ctDNA

游离DNA（cell free DNA，cfDNA）是存在于体液中的细胞外DNA，来源于正常细胞和凋亡、坏死的肿瘤细胞，而ctDNA是其中的一部分，既携带肿瘤细胞的基本遗传信息，又携带基因突变后的信息，包含点突变、重排、扩增甚至基因拷贝数变异。1948年Mandel和Metais首次报道了外周血中存在cfDNA，目前cfDNA已成为许多医学学科的热门研究领域。研究表明，通过测量ctDNA等位基因突变片段可以获得定量信息，用于肿瘤诊断并反映肿瘤负荷情况。Zhou等对原发性乳腺癌患者的肿瘤组织DNA及ctDNA进行分析，结果发现肿瘤组织DNA与ctDNA的基因突变频率显著相关（P＜0.01），并且在局部晚期（P=0.0085）或转移（P=0.0136）的乳腺癌患者血液中检测到的ctDNA最大变异等位基因频率更高，在大多数乳腺癌患者中能够检测到与肿瘤组织DNA一致的ctDNA片段，提示能够采用非侵入性的基因组谱分析原发肿瘤相关变异信息。Chae等回顾性分析了136例非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者血液中的ctDNA，结果发现较高浓度的ctDNA与较短的PFS和总生存期（overall survival，OS）有关（P＜0.01）。

Luo等通过对ESCC组织、癌旁组织和正常组织以及手术前和手术后的血浆进行测序，分析了ctDNA在ESCC中的特异性和作用，结果证明利用ctDNA检测ESCC和监测治疗效果具有可行性。Azad等通过对食管癌患者放化疗前后及健康对照组血液的DNA进行肿瘤个性化深度测序（cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP-Seq），发现放化疗后ctDNA的检出率与肿瘤进展（P＜0.01）、远处转移（P＜0.01）和较短的生存期（P＜0.01）有关。提示ctDNA可反映食管癌相关的基因信息，并与其发生、发展密切相关，有望成为反映食管癌治疗效果及预后的生物标志物。

然而，ctDNA的检测面临着巨大挑战，很大程度上是因为ctDNA通常只占总cfDNA的一小部分（＜1.0%），导致分辨困难、检测率较低，应用标准的测序方法（如Sanger测序或焦磷酸测序）只能在肿瘤负荷重的患者中检测到衍生的突变片段，导致提供的信息不全面；虽然ctDNA可以实时反映机体的全身情况，但因其在血液中的半衰期较短，导致检测困难，因此限制了其在临床上的广泛应用。

2.3 ctRNA

ctRNA是来源于肿瘤细胞的游离RNA（cell free RNA，cfRNA）的一部分。几乎所有已知类型的RNA都存在于体循环中，且每一类RNA都有可能成为恶性肿瘤生物标志物。ctRNA主要分为信使 RNA（messenger RNA，mRNA）、微小 RNA（microRNA，miRNA）和长链非编码 RNA（long noncoding RNA，lncRNA）。其中，miRNA是一类长度为18～22 bp的高度保守、内源性非编码小分子RNA，通过降解或抑制靶mRNA完成基因表达的转录后水平调控，在正常组织和肿瘤组织的动态平衡和细胞间通讯中具有关键作用。研究证实，miRNA与肿瘤发生和抑制有关，并且可以作为肿瘤诊断、检测和预后的重要生物标志物。目前为止，已在人类血液中鉴定出2500多个不同的miRNA，每个miRNA可直接或间接调节数百个靶基因，从而调节靶细胞的增殖、分化、DNA修复和凋亡等过程。

随着基因芯片技术的日益发展，循环miRNA在肿瘤的早期诊断、预后判断及治疗中显现出良好的应用前景。在ESCC中，miRNA通过调节癌基因和抑癌基因的表达，影响ESCC细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭能力，在ESCC的发病机制中发挥着重要作用。Shen等研究了96例ESCC患者与78例健康者的血清miRNA表达水平，结果发现，ESCC患者的血清miRNA-16-5p、miRNA-197-5p、miRNA-451a和miRNA-92a-3p表达水平明显升高[曲线下面积（area under the curve，AUC）=0.856，95%CI：0.794～0.905，P＜0.01]，具有作为 ESCC 诊断标志物的潜力。He等通过检测70例ESCC患者和40例健康者血浆中miRNA-20a和let-7a的表达水平，结果发现，ESCC患者血浆中miRNA-20a呈现明显高表达，let-7a则呈现明显低表达，且其表达水平与肿瘤分期有关（P＜0.05）。此外，miRNA-21在ESCC中通过抑制胱天蛋白酶（caspase）而发挥作用，且与健康对照组相比，miRNA-21的表达水平在ESCC患者血液中持续上调，然而并不是所有的miRNA表达上调。ESCC中miRNA-21已被证实是预测总体生存率及治疗反应的特异性肿瘤标志物。虽然一些研究得出了同样的结论，但单个miRNA在肿瘤诊断及预后中的价值仍需进一步证实。

循环miRNA主要来源于以下几条途径：①蛋白质-miRNA复合体以及脂蛋白复合体（例如高密度脂蛋白）中的主动分泌；②通过膜囊泡的主动分泌；③当多泡体与细胞膜融合时通过外质体的主动分泌；④来源于细胞坏死和细胞凋亡的被动分泌。miRNA在血液或体液中可长期稳定存在，煮沸、反复冻融、极端酸碱环境、长期冰冻保存等方法均不会损失循环miRNA，目前已成功应用定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）技术提取miRNA，其稳定性和特异性均较高。循环miRNA已表现出明显优势，包括在各种类型体液中的稳定性高，可抵抗内源性核糖核酸酶消化，可应用低成本、易于分析和敏感的检测方法，以上优势使循环miRNA成为潜在的新兴生物标志物。

2.4 外泌体

外泌体是被膜包裹的胞外囊泡，一般直径为40～100 nm，多种细胞在正常及病理状态下均主动分泌外泌体，它携带了各种细胞成分如蛋白质、核酸（mRNA、DNA、非编码RNA）和脂类。外泌体可以介导细胞间通讯，通过释放包含的生物因子，从而改变受体细胞的分子活动。以往的研究已证明，恶性肿瘤细胞会增加外泌体的排放，包裹在外泌体中的miRNA被释放进入体液参与肿瘤的生物学行为调控。研究表明，ESCC细胞释放的外泌体与肿瘤组织本身具有相似的成分，其释放的内容可能会影响宿主的免疫反应，如抵抗化疗药物、促进肿瘤增殖及侵袭等。因此，外泌体的miRNA表达谱是一个潜在的生物标志物，可以提供肿瘤分级和预后相关信息，从而有助于制订更好的肿瘤个体化治疗方案。

已有研究表明，黑色素瘤和纤维肉瘤分泌的外泌体释放的膜型基质金属蛋白酶-1（membrane type 1-matrix metalloproteinase，MT1-MMP）会导致胶原蛋白降解，促进肿瘤侵袭和转移。也有研究显示，高侵袭性的Hs578T三阴性乳腺癌细胞的外泌体能够显著增强乳腺癌细胞SKBR3、MDA-MB-231和HCC1954的侵袭和迁移能力。有关食管癌外泌体研究的报道较少，Li等研究发现，ESCC患者血清外泌体中的miRNA-21被受体细胞摄取后通过靶向程序性死亡受体4（programmed cell death 4，PDCD4）并激活下游的c-Jun氨基末端激酶（c-Jun NH2-terminal kinase，c-JNK）信号通路，从而促进受体细胞的侵袭和迁移。Qiu等分析了125例ESCC患者和60例健康者血清外泌体中miRNA-182的表达水平，结果发现，外泌体miRNA-182水平有助于区分健康者与ESCC患者（AUC=0.837，95%CI：0.776～0.887）；此外，高浓度外泌体miRNA-182组患者的OS和PFS均明显短于低浓度外泌体miRNA-182组（P＜0.05），因此血清外泌体miRNA-182可能是预测ESCC不良预后的有效标志物。目前仍需要更多的研究验证外泌体分析的有效性和可靠性。

3 小结

综上所述，液体活检可以作为一种新型的ES-CC检测方法，能够弥补传统活检创伤大且可重复性差等缺点，且通过分析血液中肿瘤相关生物标志物，可动态、准确地反映肿瘤进展情况。此外，液体活检提供了一种更安全、更方便的技术来获取肿瘤相关分子信息，可以低创动态地对疾病进行早期诊断，帮助临床医师及时调整治疗方案并进一步研究疾病的发生发展机制，且有助于靶向药物的研发。然而，液体活检在临床中的实际应用仍存在争议，目前仍缺乏ESCC特异性生物标志物，以上研究结果尚不能提供有力的结论证明肿瘤生物标志物检测与疾病参数的相关性。此外，基于液体活检的基因检测需要依靠一些较前沿的技术如二代测序、qRT-PCR等，同时对检测人员要求高，因而限制了其在临床中的广泛应用。因此，需要大量的相关研究验证液体活检技术在ESCC患者中的有效性和可靠性，同时需要不断地开发更简单、更准确的方法进行生物标志物监测及疗效评估等。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突