下调脂滴包被蛋白2抑制人胃癌细胞系NCI-N87增殖

刘炼玲，李 勇

(1.重庆市万州区人民医院 消化内科，重庆 404000； 2.重庆大学附属三峡医院 消化内科，重庆 404000)

胃癌(gastric cancer)是一种常见的消化道恶性肿瘤，发生于胃黏膜上皮，其发病率约占全球恶性肿瘤的7%，其病死率约占全球恶性肿瘤的9%[1]。手术切除联合辅助化疗是目前治疗胃癌的主要手段，然而对于出现侵袭、转移的病人其治疗效果不佳[2]。脂滴包被蛋白2(perilipin2)是一种能够调控脂质代谢的蛋白，保护脂肪组织，促进脂滴中三酰甘油(triglyceride，TG)的存储，为细胞增殖提供能量，并在膀胱癌、肾透明细胞癌、结肠癌等恶性肿瘤发病过程中有非常重要的作用[3]。但是，目前国内关于perilipin2与胃癌关系的报道较少，为此，本研究分析了perilipin2在胃癌中的表达及对肿瘤生物学行为的调控机制，希望从胃癌发病的分子机制方面探寻更为有效的诊疗方法应用于临床，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞来源：人正常胃黏膜细胞系GES-1(杭州美森细胞生物科技有限公司)；人胃癌细胞系NCI-N87(上海中乔新舟生物科技有限公司)。

1.1.2 主要试剂： BCA蛋白定量试剂盒(Pierce公司)；兔抗perilipin2、p62、keap1、Nrf2单克隆抗体(1∶500稀释，北京博尔西科技有限公司)；HRP标记山羊抗兔IgG二抗(1∶2 000稀释，Sigma-Aldrich公司)；ECL发光试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)；NC-shRNA、perilipin2-shRNA重组慢病毒质粒(Axygen公司)；CCK-8溶液(北京华泰昕生物医疗技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组及干预：将NCI-N87细胞分为对照组，转染10 μg NC-shRNA重组慢病毒质粒和转染10 μg perilipin2-shRNA重组慢病毒质粒，完成上述操作后继续培养48 h，转染操作按照LipofectamineTM2000转染说明书进行。

1.2.2 CCK8法检测细胞增殖率：将细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔加入100 μL细胞悬液(浓度1×105个/mL)，分别培养6、12、24、36 和48 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液，培养2 h，用酶标仪测定450 nm吸光度(A)值。

1.2.3 Transwell小室法检测细胞侵袭能力：将细胞制成细胞悬液，在Transwell小室的上室铺入基质胶(每孔60 μL)，37 ℃成胶，加入细胞悬液(浓度1×105个/mL)，每孔200 μL，在Transwell小室的下室中加入600 μL DMEM培养液，培养24 h，弃上室液体、固定、风干、0.1%结晶紫染色，PBS漂洗，在显微镜下计数穿过小室膜的平均细胞数。

1.2.4 划痕实验检测细胞迁移能力：将细胞制成细胞悬液接种于48孔板中，等到80%细胞贴壁后，用枪头沿着与皿底垂直方向划痕，PBS漂洗，加入无血清培养基，37 ℃培养24 h，观察细胞迁移轨迹，拍照记录，测量划痕间距。

1.2.5 Western blot检测perilipin2、p62、Kelch样ECH相关蛋白1(kelch-like ECH-associated protein 1,keap1)、核转录因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor-2,Nrf2)蛋白表达：取对数增殖期的GES-1细胞和NCI-N87细胞，匀浆、裂解、离心、取上清，测定蛋白浓度，取总蛋白上样于10% SDS-PAGE胶，依次电泳、切胶、转膜、封闭、洗膜、加一抗、孵育、洗膜、加二抗、孵育、洗膜、显色、定影，分析perilipin2、p62、keap1、Nrf2蛋白表达量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 NCI-N87细胞中的perilipin2蛋白表达

NCI-N87细胞中的perilipin2蛋白表达量显著高于GES-1细胞(P<0.05)perilipin2在胃癌中呈高表达 (图1)。

*P<0.05 compared with GES-1 cells

2.2 下调perilipin2表达能够抑制胃癌细胞增殖

6、12、24、36和48 h时，perilipin2-shRNA组NCI-N87细胞增殖率较对照组、NC-shRNA组低(P<0.05)(图2)。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with NC-shRNA group

2.3 下调perilipin2表达能够抑制胃癌细胞侵袭

Perilipin2-shRNA组穿过小室膜的NCI-N87细胞数较对照、NC-shRNA组低(P<0.05)(表1,图3)。

表1 各组NCI-N87细胞的侵袭和迁移能力

图3 各组NCI-N87细胞的侵袭能力

2.4 下调perilipin2表达能够抑制胃癌细胞迁移

Perilipin2-shRNA组划痕间距较对照组、NC-shRNA组宽(P<0.05)(图4)。

图4 各组NCI-N87细胞的迁移能力

2.5 下调perilipin2表达能够抑制p62-keap1-Nrf2通路相关蛋白表达

Perilipin2-shRNA组NCI-N87细胞中的perilipin2、p62、keap1、Nrf2蛋白表达量较对照组、NC-shRNA组低(P<0.05)(图5)。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with NC-shRNA group

3 讨论

Perilipin2是perilipin家族中的重要成员，存在于多种组织和细胞中，如脂肪、乳腺、胰腺、肝脏、小肠黏膜、肌肉等，能够参与脂滴的代谢，在脂滴流出与贮存的平衡中发挥重要作用，并与心血管疾病、肿瘤等疾病有关。研究发现[4]，perilipin2在病理状态如缺氧、代谢损伤等造成的细胞环境异常变化的情况下的表达水平是上调的。文献报道[5]，低氧诱导因子2α(hypoxia inducible factor 2 α，HIF2α)可使perilipin2表达增加，加速脂肪堆积，促进肾透明细胞癌肿瘤生长。资料显示[6]，perilipin2在尿路上皮细胞癌患者中表达上调，且病理分期Ⅲ～Ⅳ患者perilipin2表达水平远高于病理分期Ⅰ～Ⅱ期患者。研究发现[7]，perilipin2与膀胱癌发病及进展有关，其能促进膀胱癌细胞增殖和转移。

本研究结果提示perilipin2在胃癌中呈高表达，perilipin2可能参与了胃癌的发生。这其中可能的解释为，高脂含量，即perilipin2过度表达，会造成细胞相对缺氧，抑制铁死亡，从而促进胃癌肿瘤形成[8]。本研究通过perilipin2-shRNA重组慢病毒质粒转染构建perilipin2下调的NCI-N87细胞系，Western blot结果表明转染后的NCI-N87细胞中perilipin2蛋白表达量明显降低，同时，NCI-N87细胞中perilipin2下调后其增殖、侵袭、迁移能力明显下降。p62-keap1-Nrf2通路是一条与肿瘤细胞生物学行为关系密切的通路，p62-keap1-Nrf2在正常细胞中发挥保护作用，但在异常状态下可诱导肿瘤发生。自噬缺陷时，过表达的p62可通过与Nrf2竞争性结合Keapl，促使Nrf2稳定活化[9]。已有研究报道[10]，p62-keap1-Nrf2通路失调可见于胰腺癌、宫颈癌、膀胱癌、食管鳞癌等，该通路在上述肿瘤发生及进展过程中具有重要的作用，且Nrf2作为一个转录因子可以调控多种细胞保护基因的表达，而这些基因的表达对于胃癌的发生及发展也具有重要作用。本研究结果显示NCI-N87细胞中perilipin2下调后其p62-keap1-Nrf2通路处于受阻状态，提示perilipin2下调促进了p62表达的降低，从而减弱了其与Nrf2竞争性结合Keap1的作用，导致Nrf2被泛素化后进入蛋白酶体途径降解，减少了Nrf2启动的下游基因的转录，最终导致细胞增殖及迁移能力减弱。Perilipin2在胃癌临床诊断和治疗监测中有一定的应用潜力，有望成为抗胃癌的潜在靶标。

综上所述，perilipin2在胃癌中呈高表达，下调perilipin2表达能够抑制胃癌细胞增殖、侵袭及迁移，其机制可能与p62-keap1-Nrf2通路受阻有关，但其调控机制是否还有其他，有待研究。