敲除背根神经节Fcgr1减弱类风湿关节炎模型大鼠NF-κB/NLRP3通路活化

刘 帆，苏 思，王 涛，袁 勃，马 超

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 人体解剖与组织胚胎学系，北京 100005)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)疼痛严重影响患者生活质量，其病因尚不明确，缺乏有效的药物和治疗措施，是世界性的难题[1]。RA的常见特征是血清或受累组织中自身抗原特异性免疫球蛋白IgG，及免疫复合物(immunoglobulin G-immune complex，IgG-IC)异常升高[2-3]。

高亲和力(high affinity)免疫球蛋白G(immunoglobulin, IgG)是IgG Fc段的受体[constant fragment(Fc)-gamma receptor Ⅰ,FcγRⅠ]，主要表达于免疫细胞，能够被IgG-IC激活[3]。近年来发现，FcγRⅠ在小鼠和大鼠外周感觉神经元上表达，并与部分痛觉神经元标志物如P物质和降钙素基因相关肽等共表达[4-7]。IgG-IC可直接激活离体培养的外周神经元，还可在体引起大鼠痛觉过敏[7]。尽管IgG-IC可通过FcγRⅠ激活巨噬细胞等免疫细胞，释放炎性因子，引起疼痛[1-2, 8]。但外周感觉神经元FcγRⅠ如何直接参与RA疼痛的机制，仍未完全阐明。本研究揭示了一个外周感觉神经元通过FcγRⅠ直接参与RA疼痛发生的新机制，将为治疗RA疼痛提供新的策略和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：SPF级野生型雌性SD大鼠14只，体质重180～200 g(北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证编号SCXK〈京〉2009-0017)，7只体质重180～200 g的SPF级雌性外周感觉神经元条件敲除Fcgr1大鼠(SD大鼠遗传背景引自中国医学科学院医学实验动物研究所张连峰实验室)。条件敲除(conditional knockout, CKO)Fcgr1大鼠的打靶方案和鉴定见参考文献[9]。该研究项目通过中国医学科学院基础医学研究所伦理审查委员会审查(项目编号011-2014)。本研究所有动物的使用和实验操作严格遵循中华人民共和国国家科学技术委员会发布的《实验动物管理条例》，并给予实验动物福利关照。

1.1.2 试剂：鸡卵清蛋白(Sigma-Aldrich公司)；小鼠抗pNF-κB (p65)和GFAP一抗(Cell Signaling Technology公司)；豚鼠抗PGP9.5、兔抗IL-1β和兔抗Iba1一抗(Abcam公司)；兔抗NLRP3一抗(Proteintech公司)；兔抗IL-18一抗(Abnova公司)；Donkey anti-rabbit IgG H&L(Alexa Fluor®594)、Donkey anti-rabbit IgG H&L(Alexa Fluor®488)、Donkey anti-mouse IgG H&L(Alexa Fluor®594)、Donkey anti-mouse IgG H&L(Alexa Fluor®488)和Donkey anti-guinea pig IgG H&L(Alexa Fluor®488)荧光标记二抗(Jackson ImmunoResearch公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验动物的分组及处理：野生型大鼠随机分为对照组(control组)和类风湿关节炎(RA)组，每组7只；条件敲除Fcgr1大鼠7只建立类风湿关节炎(CKO+RA)组。根据参考文献[9]，将2.5 mg 鸡卵清蛋白(ovalbumin, OVA)溶于250 μL 0.9%氯化钠溶液，与等体积弗氏完全佐剂混合成乳剂。第0天和第7天在大鼠背部皮下注射500 μL乳剂(100 μL/点，注射5个点)。Control组为背部仅注射弗氏完全佐剂大鼠。第2次注射14 d后，大鼠右侧踝关节腔内注射50 μL OVA溶液(5 mg OVA溶于50 μL 0.9%氯化钠溶液)激发，从而建立类风湿关节炎大鼠模型。踝关节注射OVA后出现关节疼痛为RA模型成功的标志。

1.2.2 大鼠疼痛行为学的检测：根据参考文献[9-11]，使用BME-410C型热痛刺激仪检测各组大鼠热痛阈值变化，使用IITC2390型电子von-Frey检测大鼠机械痛阈值变化。疼痛行为测量分别在RA模型建立前第3和1天，及RA模型建立后第3、5、7和9天进行。

1.2.3 免疫荧光染色检测蛋白表达：实验大鼠在RA模型建立第9天后，腹腔注射1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉。4%多聚甲醛灌流，收集背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)和脊髓背角(spinal dorsal horn，SDH)，进行4%多聚甲醛固定和30%蔗糖溶液脱水后，冰冻切片(片厚12 μm)。正常马血清室温封闭1 h后，加入一抗4 ℃孵育过夜：pNF-κB (p65)(1∶200)、PGP9.5(1∶100)、NLRP3(1∶200)、IL-1β(1∶150)、IL-18(1∶200)、GFAP(1∶300)、Iba1(1∶300)；漂洗后分别加入荧光二抗(1∶1 000)，室温孵育1 h，封片后荧光显微镜观察。根据已发表文献[10]，使用ImageJ软件对DRG和SDH表达的pNF-κB (p65)、NLRP3、IL-1β、IL-18、GFAP和Iba1的荧光强度进行测定。

1.2.4 荧光原位杂交实验: 根据参考文献[9]进行确定Fcgr1条件敲除大鼠DRG中是否表达Fcgr1mRNA。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 FcγRⅠ对背根神经节神经元NF-κB/NLRP3通路活化的影响

建模前各组大鼠机械痛和热痛阈值无明显差异；模型建立后，RA组大鼠机械痛和热痛阈值与对照组大鼠相比显著下降(P<0.05)；与RA组比较，模型建立后的(RA+CKO)组大鼠机械痛和热痛阈值提高(P<0.05)(图1A，B)。

与对照组比较，RA组DRG中pNF-κB(p65)和NLRP3表达明显上调，而RA+CKO组DRG中pNF-κB(p65)和NLRP3表达较RA组下降(P<0.05)(图1C，E)。免疫荧光实验进一步显示DRG中pNF-κB(p65)与神经元标志物PGP9.5共表达(图1F)，NLRP3与pNF-κB(p65)共表达(图1G)。荧光原位杂交实验显示在野生型大鼠DRG神经元中表达Fcgr1mRNA，条件敲除大鼠DRG神经元中不表达Fcgr1mRNA(图1H，I)。

A, B.compared with control group, the mechanical and thermal pain threshold in the RA group decreased, *P<0.05 compared with control group(n=7); mechanical and thermal pain threshold of (RA+CKO) group were significantly higher than RA group,#P<0.05 compared with RA group(n=7); g.gram, s.second; C.expression of pNF-κB (p65) in the DRG of rats in each group; D.expression of NLRP3 in the DRG of rats of each group; E.fluorescent intensity analysis of pNF-κB(p65) and NLRP3 expression in the DRG of rats in each group,*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with RA group(n=7); F.co-expression of pNF-κB(p65) and neuron marker PGP9.5 in the DRG; G.NLRP3 and pNF-κB(p65) were co-expressed in the DRG; H, I.FcγR Ⅰ mRNA was detected by fluorescence in situ hybridization at DRG slices; scale bar=25 μm in C, D, F, G, H and I

2.2 FcγRⅠ对背根神经节神经元炎性细胞因子IL-1β和IL-18表达的影响

与对照组比较，炎性因子IL-1β和IL-18在RA组DRG表达升高，(RA+CKO)组中IL-1β和IL-18较RA组表达下降(P<0.05)(图2A～C)。免疫荧光染色进一步显示在DRG中IL-1β和IL-18分别与pNF-κB (p65)共表达(图2B，D)。

A.expression of IL-1β in the DRG of rats in each group; B.expression of IL-18 in the DRG of rats in each group; C.fluorescent intensity analysis of IL-1β and IL-18 in the DRG of rats in each group;*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with RA group(n=7); D.IL-1β and pNF-κB(p65) were co-expressed in the DRG; E.co-expression of IL-18 and pNF-κB(p65) in the DRG; scale bar=25 μm in A, B, D and E

2.3 神经元FcγRⅠ对类风湿关节大鼠脊髓背角胶质细胞活化的影响

与对照组比较，星形胶质细胞标志物神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和小胶质细胞标志物Iba1在RA组大鼠SDH的表达水平均增加，而(RA+CKO)组大鼠SDH中GFAP和Iba1表达较RA组降低(P<0.05)(图3A～C)。

3 讨论

近年研究发现FcγRⅠ在神经系统的神经元上表达，并可以被IgG-IC激活[7,12]。关节炎疼痛大鼠FcγRⅠ主要在DRG中与伤害性感受如疼痛发生相关的小神经元(直径一般小于30 μm)上表达上调[7]。IgG-IC通过直接激活大鼠皮肤内痛觉神经纤维末梢上的FcγRⅠ从而产生疼痛[7]。痛觉神经元持续活化可释放神经递质如谷氨酸和炎性因子如IL-1β、IL-18和TNF-α等引起中枢敏化，导致慢性疼痛的发展和维持[13]。

有研究显示大鼠踝关节注射IgG-IC引起的关节疼痛，在神经元Fcgr1敲除后明显减弱[9]。IgG-IC结合神经元FcγRⅠ，能够激活神经元内Syk信号通路，并导致细胞内钙增加[12]。Syk信号激活可引起细胞内MAPKs和NF-κB(p65)信号的活化增加，促进转录[9]。NF-κB(p65)磷酸化升高可引起IL-1β和IL-18表达增加[14]。NLRP3是炎性小体的核心成分，其高表达能够诱导IL-1β和IL-18前体成熟和分泌。NF-κB/NLRP3信号的活化与疼痛发生和慢性疼痛的维持密切相关[15]。本研究表明建立RA疼痛模型后，大鼠DRG神经元NF-κB磷酸化增加，并伴随NLRP3和炎性因子表达上调。DRG神经元能够合成，并分泌炎性因子到中枢端的SDH，引起小胶质细胞和星形胶质细胞活化，产生中枢敏化(图3D)[13]。综上所述，DRG神经元FcγRⅠ可能通过激活细胞内NF-κB/NLRP3信号参与类风湿关节炎疼痛的发生和维持。

A.expression changes of GFAP in the SDH of rats in each group; B.expression changes of Iba1 in the SDH of rats in each group; scale bar=50 μm in A, B; C.average fluorescence intensity analysis of GFAP and Iba1 in the SDH of rats in each group; *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with RA group(n=7); D.pattern diagram of the DRG FcγRⅠ regulating neuroinflammation in RA