白芨多糖上调溃疡性结肠炎小鼠肠黏膜紧密连接蛋白occludin的表达

李雨芯，余雪嫣，黄 雪

(广西医科大学第一附属医院 老年病学消化内科，广西 南宁 530021)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种主要累及结直肠黏膜与黏膜下层的的慢性、复发性肠道炎性疾病，属于炎性反应性肠病最常见的一种临床亚型。UC的发病率呈逐年增长趋势，现已发展为一种全球性疾病[1]。肠上皮屏障功能障碍是UC重要的致病因素之一[2]。肠上皮屏障受损可引起肠黏膜通透性增加，使病原微生物等通过上皮细胞进入黏膜固有层，诱导肠道炎性和免疫反应。紧密连接是肠上皮屏障最主要的构成部分，对维持肠上皮屏障的功能和完整性至关重要[3]。白芨多糖(Bletilla striata polysaccharide, BSP)来源于兰科植物白芨，具有抗感染、抗溃疡及体外免疫调节活性等多种药理作用[4]，且具有自身降解性、局部滞留性、无毒副作用等特性[5]，有潜在的临床应用前景。BSP治疗UC的具体机制尚未详尽阐明，且无对UC肠上皮屏障作用的相关研究。因此本研究主要探讨BSP对葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate，DSS)诱导的UC小鼠的作用及其对肠黏膜occludin蛋白的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物：SPF级雄性C57BL/6小鼠，8周龄，体质量18～22 g(广西医科大学动物实验中心提供，生产许可证号SCXK 桂2014-0002)。

药物及主要试剂：白芨多糖(BSP)(纯度70%，上海源叶生物科技有限公司)；DSS(MP Biomedicals公司)；柳氮磺吡啶(salazosulfapyridine，SASP，上海信谊天平药业有限公司)；大便隐血测定试剂盒[美利泰格诊断试剂(嘉兴)有限公司]；高效RIPA组织快速裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；4%多聚甲醛(北京白鲨易科技有限公司)；兔抗occludin单克隆抗体(Abcam公司)；内参GAPDH抗体(Cell Signaling Technology公司)；兔二抗(Earthox公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分组与药物干预：将小鼠随机分为对照组、DSS模型组(自由饮用2.5% DSS溶液7 d)、SASP阳性对照组(300 mg/kg)以及BSP低(125 mg/kg)和高(250 mg/kg)剂量组，每组6只。BSP的干预剂量参照文献[6]。从建模开始灌胃给药，1次/d,连续7 d。

1.2.2 取材及样本的处理：给药结束后禁食12 h，腹腔注射4%水合氯醛麻醉并处死。分离肛门至回盲部的肠管，测量结肠长度后，将结肠分成2份，1份置于-80 ℃冰箱用于Western blot实验，另1份置于4%的多聚甲醛中固定，用于苏木精-伊红(HE)染色。

1.2.3 疾病活动指数(disease adivity index,DAI)评分：每天记录小鼠的体质量变化、大便性状及大便隐血/便血情况，并进行DAI评分。评分标准参照文献[7](表1)。DAI=[体质量下降(%)评分+大便性状评分+大便隐血/便血评分]/3。

表1 疾病活动指数评分(DAI)

1.2.4 结肠组织形态学观察和评分：将结肠置于4%多聚甲醛中固定24 h以上，进行常规HE染色后观察结肠黏膜形态学变化，并进行组织病理学评分，评分标准参照文献[8]。

1.2.5 Western blot检测结肠组织occludin蛋白的表达：提取结肠组织总蛋白并用BCA法测蛋白浓度，12% SDS-PAGE分离后，将蛋白转至PVDF膜，室温下封闭1 h。然后置于相应一抗中，4 ℃孵育过夜。1×TBST洗膜，置于二抗中室温避光孵育1 h。采用Licor Odyssey V3.0软件扫膜和Image J软件分析结果。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 BSP对UC小鼠体质量变化(%)和DAI评分的影响

造模第7天，对照组、DSS模型组、SASP阳性对照组和BSP低、高剂量组小鼠的体质量变化(%)依次为103.8±2.5、83.0±3.7、95.1±0.9、88.5±1.7、91.7±1.3(P<0.05)。与对照组比较，DSS模型组小鼠 DAI 评分显著升高(P<0.01)。与DSS模型组比较，BSP低、高剂量组小鼠 DAI 评分均降低(P<0.05)(图1)。

#P<0.01 compared with control group；*P<0.05 compared with model group

2.2 BSP对UC小鼠结肠长度的影响

与对照组比较，DSS模型组小鼠结肠长度显著缩短(P<0.01)；与DSS模型组比较，BSP低、高剂量组小鼠结肠缩短程度均减轻(P<0.05)(表2)。

2.3 BSP对UC小鼠结肠组织病理学表现和评分的影响

对照组小鼠结肠黏膜上皮结构完整，腺体、隐窝形态正常，排列整齐，偶见炎性细胞浸润。DSS模型组小鼠结肠黏膜上皮严重缺失，腺体、隐窝变形破坏甚至消失，杯状细胞显著减少，黏膜和黏膜下层可见广泛炎性细胞浸润。BSP低、高剂量组小鼠结肠黏膜损伤程度较DSS模型组均得到不同程度的改善，腺体、隐窝结构破坏、炎性细胞浸润均有所减轻，杯状细胞增加(图2)。与对照组比较，DSS模型组小鼠结肠组织病理学评分显著升高(P<0.01)；与DSS模型组比较，BSP低、高剂量组小鼠组织病理学评分均降低(P<0.05)(表2)。

图2 各组小鼠结肠组织病理学表现

2.4 BSP对UC小鼠结肠组织occludin蛋白表达的影响

与对照组比较，DSS模型组小鼠结肠组织紧密连接蛋白occludin表达显著减少(P<0.01)；与DSS模型组比较，BSP低、高剂量组occludin蛋白表达均显著增加(P<0.01)(图3，表2)。

图3 Western blot检测结肠组织occludin蛋白的表达

表2 各组小鼠结肠长度、组织病理学评分和结肠组织occludin蛋白相对表达量比较

3 讨论

BSP是从传统中药白芨块茎中提取的一种天然高分子黏性多糖，被广泛应用于食品和药物的制备，具有潜在的临床应用前景。BSP可通过减少TNF-α、IL-1β，增加IL-10[9]，抑制炎性反应和氧化应激以及TLR4/NF-κB信号通路的激活[6]，促进UC小鼠结肠黏膜损伤修复和抑制相关免疫反应[10]，进而缓解小鼠结肠炎。本研究发现，BSP能够显著改善DSS诱导的UC小鼠的体质量减轻、结肠缩短，修复结肠黏膜损伤和减少炎性细胞浸润，降低DAI评分和组织病理学评分。且呈剂量依赖性，剂量越高，效果越好。表明BSP可以减轻UC小鼠的炎性反应，对UC小鼠具有显著的疗效。

肠上皮屏障的功能和完整性主要由紧密连接调控[11]。在UC中，紧密连接破坏和紧密连接相关蛋白表达异常被认为是介导肠上皮屏障功能障碍的主要机制[12]。Occludin蛋白是首个被发现的跨膜蛋白，由4个横跨膜区域、1个细胞内环和2个细胞外环构成，具有封闭相邻细胞间隙、调节信号传导分子的聚集以及调控物质的细胞旁转运等作用。Occludin蛋白在丝氨酸和苏氨酸残基上高度磷酸化，通过磷酸化在紧密连接的组装和通透性中发挥至关重要的作用[13]。Occludin蛋白在UC患者和DSS诱导的UC小鼠结肠组织中均显著降低，且occludin蛋白的敲除可导致大分子物质的细胞旁通透性增加[14]。因此occludin蛋白的表达量在一定程度上反映了肠上皮屏障通透性和功能的改变。本研究发现，给予2.5% DSS造模后小鼠结肠组织occludin蛋白表达显著减少，若同时给予BSP干预，occludin蛋白的表达较DSS模型组显著增多。表明BSP可以上调occludin蛋白的表达，改善肠上皮屏障的功能和完整性。

综上所述，BSP可以减轻DSS诱导的UC小鼠的结肠炎性反应，其作用机制可能与其上调肠黏膜occludin蛋白的表达，从而保护肠上皮屏障有关。