线粒体4977-bp缺失对鼻咽癌的影响

袁妮娜 楼响瑜 冷建杭

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是指发生于鼻咽腔顶部和侧壁的恶性肿瘤，是我国高发恶性肿瘤之一，发病率为耳鼻咽喉恶性肿瘤之首。在中国，NPC的高发区主要集中在广东、广西、湖南、福建和江西5省，其中以广东省为高发，发病率在25/100 000～30/100 000[1]。迄今为止，NPC的发病机制仍未完全阐明，有研究表明NPC可能由环境因素、遗传因素以及EB病毒感染引起，遵循多基因-环境交互作用的模式[2-4]。然而，大部分遗传因素方面的研究均集中于核基因，NPC和线粒体基因组的关系目前尚不清楚。线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是一种细胞核外唯一的遗传物质，全长为16，569-bp[5]。由于mtDNA缺乏组蛋白保护，因此对辐射等氧化损伤较为敏感。此外，mtDNA损伤修复能力低，可造成核酸片段缺失，其中线粒体4977-bp缺失最为常见[6-7]。线粒体4977-bp缺失位于线粒体序列13-bp的正向重复序列（5'-ACCTCCCTCACC-3'），即 8470～8482 和 13447～13459 之间[8]。本研究旨在分析线粒体4977-bp缺失对NPC的影响，并对携带该缺失的患者进行线粒体功能分析，探讨NPC发病的可能分子机制。

1 对象和方法

1.1 对象 收集2019年1至12月在杭州市第一人民医院耳鼻喉科手术的NPC患者66例，采集鼻咽纤维镜活检的肿瘤组织约50 mg，均经病理确诊。其中男44例，女22例；年龄22～61岁，中位年龄40岁。本研究经本院医学伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 全基因组DNA提取 采用改进的酚、氯仿、异戊醇提取法提取肿瘤组织中的DNA。首先将肿瘤组织放在1.5 ml离心管中，分别用75%和50%的乙醇和纯水梯度脱乙醇，将组织放入研钵中，加入DNA裂解液；随后将研磨好的组织液加入离心管，并加入10 μl的蛋白酶K，加入等体积的酚后离心，分为3层，吸取上层液，加入饱和酚、氯仿和异戊醇（比例为25:24:1）混合液后摇匀继续离心，吸取上清液后加入等体积的氯仿和异戊醇混合液400 μl，离心后加入2.5倍体积的100%乙醇，冷冻过夜后将样品取出12 000 r/min离心，白色沉淀物即为DNA。将所得的DNA溶于双蒸水，-20℃冰箱保存备用，并用紫外分光密度仪检测所提取的DNA浓度。

1.3 线粒体4977-bp缺失检测 采用巢式PCR检测肿瘤组织中线粒体4977-bp缺失情况，利用Primer Premier 5.0软件设计两对引物，引物序列见表1。其中外F和外R用于扩增4977-bp缺失区域两端较长区域序列，内F与内R用于扩增4977-bp缺失区域两端较短区域序列。在PCR管中，加入Takara Taq酶0.1 μl，10×Buffer 2 μl，dNTP 2 μl，Mg2+1.5 μl，正反向引物各0.4 μl，模板 DNA 1.2 μl，加入去离子水至 25 μl。反应条件为95℃预变性5 min，95℃变性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸40 s，共35个循环，72℃延伸5 min。第1次使用外引物进行扩增，第2次使用内引物，模板为第1次PCR的产物。反应结束后取5 μl的PCR产物于加有溴化乙锭的1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

表1 线粒体4977-bp缺失检测的PCR引物序列

1.4 携带线粒体4977-bp缺失患者线粒体功能分析

1.4.1 mtDNA拷贝数分析 分别抽取2例携带线粒体4977-bp缺失患者（NPC-1和NPC-2）和2例性别、年龄相仿的健康体检者外周静脉血3 ml，提取基因组DNA。使用线粒体ND1基因来确定mtDNA的拷贝数，选用β-actin作为看家基因。其中，扩增线粒体ND1基因和β-actin的引物序列见表2。使用荧光定量PCR法检测mtDNA的拷贝数，95℃10 min预变性后，95℃变性15 s，60℃退火1 min（荧光检测）共40个循环进行扩增，随后95℃变性15 s，60℃退火1 min，95℃变性15 s，60℃退火15 s进行熔解曲线分析，使用2-ΔΔCt法计算出拷贝数[9]。

表2 mtDNA拷贝数检测所需的引物序列

1.4.2 线粒体ATP水平分析 采用Ficoll密度梯度离心法[10]分离NPC-1和NPC-2患者和2例健康体检者的外周血单核细胞。ATP定量分析使用CellTiter-Glo发光法细胞活力检测试剂盒，方法如下：将CellTiter-Glo试剂直接加入携带4977-bp缺失患者和健康体检者的单核细胞中，10 min后检测荧光信号强度，细胞裂解产生的发光信号与ATP含量成正比[11]。

1.4.3 活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平分析由于ROS是线粒体产生的氧自由基，对细胞、组织和蛋白有一定的损伤作用，ROS的过量表达是线粒体功能损伤的指标[12]。ROS的检测基于一种荧光染料2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2',7'-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）的强度，DCFH-DA 本身没有荧光，进入细胞后，被细胞内的酯酶水解成2',7'-二氯二氢荧光素（2',7'-Dichlorodi-hydrofluorescein，DCFH），和探针特异性结合，细胞内的ROS可以氧化无荧光的DCFH变成有荧光的2',7'-二氯荧光素（2',7'-Dichlorofluorescein，DCF），荧光强度与ROS水平成正比，使用流式细胞仪计算荧光强度，计算ROS水平[13]。

2 结果

2.1 线粒体4977-bp缺失情况 巢式PCR法可以扩增出358-bp的片段，而不含4977-bp缺失的个体，无法扩增出358-bp的片段，见图1。66例NPC患者中有2例携带线粒体4977-bp缺失（NPC-1和NPC-2），检出率为3.03%。

图1 线粒体4977-bp缺失的巢式PCR电泳图[孔道1为空白对照，孔道2和3表示携带线粒体4977-bp缺失的样本（NPC-1和NPC-2）]

2.2 mtDNA拷贝数分析 mtDNA拷贝数分析发现，NPC-1和NPC-2的mtDNA拷贝数分别为161.5和167.0，远高于健康体检者的70.6。

2.3 线粒体ATP水平分析 ATP水平检测发现，NPC-1和NPC-2的ATP含量分别为57.0和63.0，明显低于健康体检者的140.66。

2.4 ROS定量分析 ROS定量分析发现，NPC-1和NPC-2患者的ROS水平分别为99.0、107.5 U/ml，明显高于健康体检者的45.6 U/ml。

3 讨论

早在1956年，生物学家Warburg[14]在癌细胞中首次发现了一种称为“有氧糖酵解”现象，就是大多数癌细胞即使在有充分氧供应的条件下仍主要通过糖酵解途径而不是氧化磷酸化途径来获得ATP用于维持自身代谢及分裂增殖，同时产生大量乳酸代谢产物，该效应也称为Warburg现象，为癌细胞线粒体功能障碍的研究奠定了基础。

由于线粒体基因组缺乏保护性组蛋白，修复能力非常有限，本身又是产生ROS的主要场所，因此mtDNA的突变率远高于核DNA[15]。有研究发现，mtDNA的4977-bp缺失是一种较为常见的突变，在癌症中尤为常见[16-17]。Guo等[18]对105例肝癌患者进行了线粒体4977-bp缺失的筛查，发现有10个患者携带该大片段的缺失。Tan等[19]应用PCR技术分析乳腺癌肿瘤组织中常见的4977-bp缺失，19例肿瘤标本均未检测到该缺失。沈慧等[20]对52例新鲜胃癌标本的研究表明4977-bp缺失阳性率为73.1%。从分子结构上看，线粒体4977-bp的缺失位于核苷酸位点的8470～13446之间的区域，缺失区编码 5 个线粒体 tRNA、A8、A6、CO3、ND3、ND4L、ND4和ND5。因此，4977-bp的大片段缺失会影响线粒体的结构和功能，引起线粒体功能损伤，但是具体的分子机制尚不清楚。

本研究中，笔者首先利用巢式PCR法对NPC患者进行了线粒体4977-bp缺失的检测，共发现2例NPC患者携带这个大片段的缺失，检出率为3.03%；并对2例携带线粒体4977-bp缺失的NPC患者和2例健康体检者进行了线粒体功能研究，包括mtDNA拷贝数、ATP和ROS水平。本研究发现，携带4977-bp缺失NPC患者的mtDNA拷贝数和ROS明显高于健康体检者，而ATP水平明显低于健康体检者。笔者认为mtDNA对很多致癌因素敏感，是ROS攻击的主要目标，当细胞受到外源性物质的攻击时，使得线粒体总呼吸的代偿，导致mtDNA的拷贝数增高。在癌细胞缺氧的情况下，线粒体氧化磷酸化功能受到抑制，ROS水平急剧上升，但是超氧化物歧化酶由于酶的活性改变，清除能力下降，引起线粒体大片段的缺失[21]。此外，由于线粒体功能损伤，呼吸链合成受阻，导致ATP水平下降，进而参与了NPC的发病进程。

综上所述，本研究发现线粒体4977-bp缺失和NPC有关，很有可能是通过影响线粒体氧化磷酸化功能而参与了NPC的发病进程，本研究为NPC的发病机制提供了新思路。本研究不足之处是标本量较少，需要继续扩大样本量来开展后续的工作。