蒙古扁桃不同极性部位对肝纤维化大鼠的保护作用及机制研究

吴 桐，周红兵，王 佳，常 虹，白万富，权博文，郝海梅，白迎春,*，石松利,*

（1.包头医学院药学院，内蒙古包头 014040；2.弘慈医疗集团包钢三医院，内蒙古包头 014010）

肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）是肝脏对慢性损伤的一种修复反应，是慢性肝病共有的病理改变[1]。它是肝硬化及各种终末期肝病复杂病症如肝门静脉高压、肝腹水、合成功能紊乱、代谢能力受损等发生的基础，严重威胁人类健康，但也是其早期可逆阶段[2]。目前针对肝纤维化的治疗如秋水仙碱、皮质类固醇等经典药物存在较高的副反应发生率，制约了肝纤维化的治疗[3]。近年来，研究发现中药在治疗肝纤维化方面有独特的优势[4−6]，中药治疗肝纤维化已成为人们研究的热点[7]。

蒙古扁桃（Amygdalus mongolica）蒙名乌兰-布衣勒斯属蔷薇科扁桃属旱生落叶灌木，为蒙古高原特有的阿拉善荒漠种[8−10]，其分布区阿拉善荒漠区是我国八大生物多样性中心之一，特殊的环境胁迫造成了次生代谢产物结构多样性和生物活性多样性，也为获得高效低毒的药用生物活性成分提供了新的来源[11]。蒙古扁桃富含总黄酮、蛋白质、脂肪酸、有机酸、多糖、维生素E 等营养和药用成分[12]。蒙古扁桃作为一味传统的中药材以种仁入药，可代“郁李仁”[13]，性苦，味平，主治咽喉干燥、干咳及支气管炎、阴虚便秘，能润燥滑肠、利尿，主治大便燥结、水肿、脚气等症[14]。课题组前期研究表明，蒙古扁桃油具有调血脂、提高肝脏抗氧化功能和保护肝脏的作用[15−17]，已证实蒙古扁桃具有较好防治肝、肺、肾纤维化的作用，并已明确蒙古扁桃石油醚提取物和正丁醇提取物为抗肾纤维化和抗肺纤维化作用有效部位[18−19]，但其抗肝纤维化作用的有效部位有待进一步明确。本实验在前期研究基础上，通过建立稳定的大鼠肝纤维化模型，灌胃蒙古扁桃石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水部位提取物，通过对大鼠生理指标、肝脏组织的形态学、纤维化指标、血清生化指标、组织生化指标及分子生物学等方面的分析，筛选出蒙古扁桃对大鼠肝纤维化保护作用的有效部位，为进一步挖掘蒙古扁桃药材新的药理作用及开发治疗抗纤维化药物提供科学依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蒙古扁桃药材 蒙古扁桃种子采自阿拉善雅布来戈壁，经包头医学院药学院石松利教授鉴定为蒙古扁桃（Amygdalus mongolica）；水飞蓟素胶囊（批号131102819） 德服博士大药厂；CCl4（批号：20091217） 天津市北方天医化学试剂厂；ALT、AST 和ALP 试剂盒 美国贝克曼公司；MDA 试剂盒（批号：20150421）、SOD 试剂盒（批号：20150505）、HYP 试剂盒（批号：20150527）、总蛋白定量测定试剂盒（批号：20150519） 南京建成生物工程研究所；HA 试剂盒、LN 试剂盒、PC-Ⅲ试剂盒、Col-Ⅳ试剂盒（批号：20151020） 北京北方生物技术研究所有限公司；mRNA 提取试剂TRIzol Thermo Fisher Scientific 公司；逆转录试剂盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo Fisher Scientific 公司；qPCR 试剂RealSYBR Mixture 康为世纪公司；PCR 引物 宁夏科诺嘉华生物工程有限公司。SPF 级SD 雄性大鼠，体质量170～200 g（许可证号SCXK（京）2011-0012） 北京大学医学部（实验动物科学部）。

TGL-16M 型高速台式冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；RE-52A 型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；GENIUS 5K-D 全自动脱帽离心机 长沙鑫奥仪器；AU640 全自动生化分析仪日本奥林巴斯公司；CX31 显微镜 日本奥林巴斯公司；Vlultifuge X1R 高速冷冻离心机 美国赛默飞公司；7500 型qPCR 仪 美国AB 公司；NanoDrop 2000 微量分光光度计 美国赛默飞公司；7500 型qPCR 仪 美国AB 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蒙古扁桃不同极性部位提取物的制备 取蒙古扁桃生药研碎，置于索氏提取器中，用10 倍体积的95%乙醇（v/v）水浴提取3 次，每次2 h；再用10倍体积的50%乙醇（v/v）提取3 次，每次2 h，得粗提液[20]。分别使用旋转蒸发仪和水浴锅浓缩粗提液至膏状。将粗膏依次分别以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取得到各部位提取物，得率分别为石油醚部位56.68%、乙酸乙酯部位8.38%、正丁醇部位23.35%、水部位11.59%。

1.2.2 建立动物模型、分组及给药 将70 只SD 大鼠随机分为正常对照组、纤维化模型组、水飞蓟素阳性对照组及蒙古扁桃石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位提取物7 组，每组10 只。大鼠肝纤维化造模方法参照文献[21−23]，用橄榄油将CCl4配制成40%橄榄油液，除对照组之外，其余各组大鼠按体重腹部皮下注射40% CCl4橄榄油液3 mL/kg（首次5 mL/kg），每周2 次，持续8 周。造模同时给药，蒙古扁桃石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位提取物组给药剂量均为1.5 g/kg（生药剂量），以0.01 g/mL 的水飞蓟素溶液按大鼠体重5 mL/kg灌胃给药，模型组和正常对照组按大鼠体重5 mL/kg灌胃给蒸馏水，每天灌胃1 次。实验过程中每天注意观察大鼠的反应、饮水饮食、粪尿排泄、毛发光泽等基本情况。

1.2.3 血清及肝脏的采集 末次给药禁食不禁水24 h后，称量各组大鼠体质量，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，腹主动脉取血，血液以4 ℃下，以6000 r/min 冷冻离心，分离血清，置于−80 ℃冰箱保存，用以检测各项血清生化指标。各组大鼠处死后取其肝脏、脾，观察肝脾色、质、形态等情况，称质量用于计算肝脾指数和脾指数（肝指数=肝质量/体质量×100%，脾指数=脾质量/体质量×100%），从肝右叶中相同部位切取肝组织一块做苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE 染色）、马松染色（Masson 染色）。

1.2.4 观察各项指标及检测方法

1.2.4.1 HE 及Masson 胶原染色观察肝脏病理学形态 将经福尔马林溶液固定后的肝脏组织常规脱水，石蜡包埋，切片进行HE 及Masson 胶原染色，于光镜下观察（×100）各组大鼠肝脏的肝纤维化程度[24−25]。

1.2.4.2 生化指标测定 血清ALT、AST、ALP、SOD、MDA 含量组织中的SOD 和MDA 均采用全自动生化检测仪测量。

1.2.4.3 肝纤维化指标测定 血清中HA、LN、PC-Ⅲ、Col-Ⅳ采用夹心酶联免疫吸附试验法（ELISA 法），严格按照试剂盒说明书进行操作；肝组织中HYP 的测定，按照试剂盒方法测定。

1.2.4.4 荧光定量PCR 扩增实验 引物序列如表1：

表1 PCR 引物序列Table 1 PCR primer sequence

PCR 扩增反应体系：

50 μL 反应体系：2×RealSYBR Mixture 25 μL，Forward Primer 10 μmol/L 1 μL，Reverse Primer 10 μmol/L 1 μL，Template DNA 2 μL，ddH2O Up to 50 μL。

qPCR 实验参数：

扩增条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 20 s，40 个循环；72 ℃ 2 min。

1.3 数据处理

实验数据处理采用SPSS17.0 软件进行分析，实验结果以平均值±标准差表示（±s，n=10），采用单因素方差分析对各组均数进行比较，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 各组大鼠一般情况

结果见表2，与正常对照组比较，模型组大鼠的体质量显著降低（P<0.05）；与模型组比较，蒙古扁桃各极性部位组大鼠的体质量升高，差异有显著性（P<0.05）。实验中，正常对照组大鼠情况良好。各造模组大鼠第2 周开始出现精神萎靡，食量减少，背毛脱落，皮肤溃烂等情况。给药期间，水飞蓟素组、蒙古扁桃药材各部位提取物治疗组大鼠进食、皮毛、活动等情况有所改观。第8 周，处死大鼠时观察到正常对照组大鼠肝脏颜色鲜红，质嫩；模型组大鼠肝脏表面颜色褐色，质硬，有花斑样改变，个别大鼠肝脏颗粒样变严重；各给药组较模型组变化轻。

表2 蒙古扁桃药材不同极性部位对大鼠体质量的影响Table 2 Effects of different polar parts of Amygdalus mongolica on rat body quality

2.2 蒙古扁桃药材不同极性部位对肝指数和脾指数的影响

结果见表3，与正常对照组比较，模型组大鼠的肝、脾指数均明显升高，差异有显著性（P<0.05）。与模型组比较，蒙古扁桃石油醚、水部位均能明显降低大鼠的肝指数，降幅分别为11.11%和14.49%，差异有显著性（P<0.05）。水飞蓟素及蒙古扁桃各部位给药组均有降低大鼠的脾指数趋势，但无显著性差异（P>0.05）。郭羽轩[26]研究结果表明睡莲花总黄酮高剂量组能极显著降低大鼠肝脏指数（P<0.01）；睡莲花总黄酮低、中和高剂量组均能显著降低肝纤维化大鼠的脾脏指数（P<0.05）；睡莲花总黄酮低、中剂量组均能显著增加大鼠体质量（P<0.05），睡莲花高剂量组能极显著增加大鼠体质量（P<0.01）。本实验结果表明，蒙古扁桃石油醚和水部位具有明显下调肝指数的作用。

表3 蒙古扁桃药材不同极性部位对大鼠肝指数、脾指数的影响Table 3 Effects of different polar parts of Amygdalus mongolica on rat liver index and spleen index

2.3 蒙古扁桃药材不同极性部位对肝功能 ALT、AST、ALP 的影响

由表4可知，与正常对照组比较，模型组血清ALT，AST 和ALP 活力明显升高，差异有显著性（P<0.05），表明采用四氯化碳造模能使大鼠的肝功能受损。与模型组比较，蒙古扁桃正丁醇部位能显著降低血清ALT 活力（P<0.05）；蒙古扁桃石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部位能显著降低血清AST 活力（P<0.05），降幅分别为26.99%、55.54%和55.91%；蒙古扁桃石油醚、正丁醇、水部位及水飞蓟素能降低血清ALP 活力（P<0.05），降幅分别为32.75%、36.61%、27.66%和42.09%。陈淳[27]研究结果表明，红背叶根乙醇、正丁醇提取物能极显著降低肝纤维化大鼠血清ALT 和AST 水平（P<0.01）。本结果提示蒙古扁桃石油醚部位和正丁醇部位有明显改善AST 和ALP活力作用，对肝纤维化大鼠肝功能起到保护作用，且蒙古扁桃正丁醇部位效果更佳。

表4 蒙古扁桃药材不同极性部位对大鼠血清ALT，AST，ALP 的影响Table 4 Effects of different polar parts of Amygdalus mongolica on ALT,AST and ALP in rat serum

2.4 蒙古扁桃药材不同极性部位对肝纤维化大鼠肝组织中HYP 的影响

结果见表5，与正常对照组比较，模型组大鼠肝组织中的HYP 含量明显升高，差异有显著性（P<0.05），表明采用四氯化碳造模能使大鼠的肝功能受损。与模型组比较，蒙古扁桃石油醚部位、正丁醇部位和水飞蓟素组大鼠肝组织中的HYP 含量降低，差异有显著性（P<0.05），降幅分别为36.42%、38.85%和38.17%；蒙古扁桃乙酸乙酯和水部位组大鼠肝组织中的HYP 含量有降低趋势，但无显著性差异（P>0.05）。结果提示蒙古扁桃石油醚和正丁醇部位有明显改善HYP 的作用，在实验剂量和时间内恢复HYP 含量接近正常对照组水平，且蒙古扁桃正丁醇部位效果更佳。

表5 蒙古扁桃药材不同极性部位对大鼠肝组织 HYP 的影响Table 5 Effects of different polar parts of Amygdalus mongolica on HYP of liver tissue in rats

2.5 蒙古扁桃药材不同极性部位对肝纤维化大鼠肝脏病理组织学的影响

HE 染色结果如图1所示，正常对照组大鼠的肝组织结构完整清晰，肝细胞大小均匀，未见炎症细胞变性及坏死现象。模型组的大鼠多数小叶结构遭到破坏，结构紊乱，干细胞出现气球样变，肝脏汇管区和小叶间有胶原纤维沉积，说明本实验成功建立了大鼠肝纤维化模型。与模型组比较，蒙古扁桃各部位给药组和水飞蓟素组的大鼠肝组织损伤明显减轻，肝细胞脂肪变性及坏死显著减少，细胞炎症明显减轻。

图1 蒙古扁桃药材不同极性部位对肝纤维化大鼠肝脏病理组织学的影响(HE 染色，×100)Fig.1 Effects of different polar regions of Amygdalus mongolica on liver histopathology in rats with liver fibrosis（HE staining，×100）

Masson 染色结果如图2所示：正常对照组的大鼠肝小叶结构正常，肝细胞形态规则，仅在汇管区有少量胶原纤维存在。模型组的大鼠肝脏汇管区周围及肝小叶之间有大量粗大的胶原纤维增生，呈宽带状增生的胶原纤维形成条索状纤维分隔，导致正常的肝小叶结构遭到破坏，形成了假小叶。蒙古扁桃各给药组的大鼠肝组织中胶原纤维明显减少，病变减轻，肝小叶结构有不同程度的恢复正常，且以蒙古扁桃石油醚部位和正丁醇部位组恢复较为显著。

图2 蒙古扁桃不同极性部位对肝纤维化大鼠肝脏病理组织学的影响（Masson 染色，×100）Fig.2 Effects of different polarity of Amygdalus mongolica on liver histopathology in rats with liver fibrosis (Masson staining,×100)

2.6 蒙古扁桃药材不同极性部位对血清及肝脏组织MDA、SOD 的影响

结果见表6，与正常对照组比较，模型组的大鼠血清中SOD 含量明显下降，血清及组织中MDA 含量明显升高，差异有显著性（P<0.05），表明采用四氯化碳造模能使大鼠过氧化，引起肝功能受损。与模型组比较，蒙古扁桃各部位给药组和水飞蓟素组血清SOD 含量明显升高，差异有显著性（P<0.05），其中蒙古扁桃石油醚部位增幅为最高33.14%；蒙古扁桃各部位给药组和水飞蓟素组血清及组织中 MDA 含量明显降低，差异有显著性（P<0.05），其中蒙古扁桃石油醚部位组血清和组织中MDA 的降幅分别高于其他组，降幅分别46.01%和73.23%。蒙明瑜[28]研究结果表明，剑叶耳草乙酸乙酯、正丁醇和水部位能降低肝纤维化小鼠织中MDA 活性（P<0.05）和升高SOD 活性（P<0.05）。本实验结果提示蒙古扁桃各给药组均有明显抗氧化功能，能改善SOD 和MDA 的水平，且以蒙古扁桃石油醚部位效果更佳。

表6 蒙古扁桃药材不同极性部位对大鼠血清及肝组织中 SOD、MDA 的影响Table 6 Effects of different polar parts of Amygdalus mongolica on SOD and MDA in serum and liver tissues of rats

2.7 蒙古扁桃不同极性部位对肝纤维化大鼠血清中纤维化指标的影响

结果见表7，与正常对照组比较，模型组血清HA、PC-Ⅲ和Col-Ⅳ水平升高，差异有显著性（P<0.05），表明采用四氯化碳造模能使大鼠的肝功能受损。与模型组比较，蒙古扁桃各部位提取物组和水飞蓟素组血清中的HA 明显降低，差异有显著性（P<0.05），其中水飞蓟素组降幅为最高54.88%；蒙古扁桃石油醚部位、正丁醇部位和水飞蓟素组PC-Ⅲ明显降低，差异有显著性（P<0.05），降幅分别为49.54%、66.67%和11.52%；蒙古扁桃各部位和水飞蓟素组血清中的Col-Ⅳ有降低趋势，但差异无显著性（P>0.05）；结果提示蒙古扁桃石油醚部位和正丁醇部位具有明显改善肝纤维化大鼠HA 和PC-Ⅲ的作用。

表7 蒙古扁桃药材不同极性部位对大鼠血清肝纤维化指标 HA、LN、PC-Ⅲ及 Col-Ⅳ的影响Table 7 Effects of different polar parts of Amygdalus mongolica on serum liver fibrosis indexes HA,LN,PC-Ⅲ and Col-Ⅳ in rats

2.8 蒙古扁桃药材不同极性部位对肝纤维化大鼠TGF-β1/Smad 信号传导通路的影响

结果见表8，与正常对照组相比，模型组的肝组织TGF-β1、Smad3 mRNA 表达水平显著上调，差异有显著性（P<0.05）。与模型组比较，蒙古扁桃各部位和水飞蓟素组均可抑制肝纤维化大鼠组织中TGFβ1 表达水平，差异有显著性（P<0.05），其中蒙古扁桃水部位降幅为最高64.50%；蒙古扁桃石油醚部位、乙酸乙酯、正丁醇部位和水飞蓟素组可抑制肝纤维化大鼠组织中的Smad3 mRNA 表达水平，差异有显著性（P<0.05），其中蒙古扁桃石油醚部位降幅为最高41.30%。实验结果表明，蒙古扁桃石油醚部位、乙酸乙酯和正丁醇部位均可以调节TGF-β1 和Smad3 mRNA 的表达水平，其抗肝纤维化机制可能是通过对TGF-β 纤维化通路的调节来起作用的。

表8 蒙古扁桃不同极性部位对肝纤维化大鼠TGF-β1/Smad 信号传导通路的影响Table 8 Effects of different polarity of Amygdalus mongolica on TGF-β1/Smad signaling pathway in hepatic fibrosis rats

3 讨论与结论

本论文采用CC14诱导大鼠建立肝纤维化模型，通过组织病理学（HE 染色、Mission 染色）、HA、HYP、AST 等生化指标及TGF-β1、Smad3、Smad7表达水平的变化，综合分析该药材不同极性部位对肝纤维化大鼠干预作用，探讨蒙古扁桃药材抗肝纤维化有效部位并对其作用机制进行了深入研究。四氯化碳是经典的肝毒性试剂，是最早和目前使用最广泛的诱发肝纤维化的毒剂[29]，因此本文采用了CC14造模方法。实验结果表明，CCl4致大鼠纤维化模型组血清中ALT、AST、ALP 活性显著升高，血清中SOD含量显著下降，血清及组织中MDA 含量显著升高，致大鼠过氧化，引起肝功能受损。给予蒙古扁桃不同极性部位干预后，蒙古扁桃正丁醇部位显著降低ALT、AST、和ALP 活性，蒙古扁桃石油醚部位显著降低AST 和ALP 活性，说明蒙古扁桃石油醚部位和正丁醇部位有明显改善AST 和ALP 的作用，对肝纤维化大鼠肝功能起到保护作用；蒙古扁桃各极性部位均能显著提高肝纤维化大鼠血清中的SOD 含量，并显著降低血清和组织中的MDA 含量，提示蒙古扁桃各极性部位有清除活性氧及抗脂质过氧化作用，能够拮抗CCl4的毒性。据文献报道，CC14可直接溶解肝细胞膜，引起脂质过氧化反应，导致肝细胞损伤[30]。当肝细胞受损时，主要存在于肝细胞中的ALT、AST、ALP 会被释放进入血液，表现为血清ALT、AST、ALP 水平升高[31]，因此血清中ALT、AST、ALP 水平可反映肝脏受损的程度[32]。本实验结果也证明了大鼠模型组血清中的ALT、AST、ALP 水平显著升高，而蒙古扁桃石油醚部位和正丁醇部位有明显调节AST 和ALP 的水平，对肝纤维化大鼠肝功能起到了保护作用。

肝纤维化患者的细胞外基质大量生成并沉积于肝脏，HA、LN、PC-Ⅲ、Col-Ⅳ是肝脏纤维组织主要基质成分，其血清水平可反映肝纤维化严重程度[33]，是反映肝纤维化的灵敏指标[31]，羟脯氨酸（HYP）是胶原蛋白中特征性的氨基酸成分，肝组织HYP 含量也可反映纤维化的程度[34]。因此，本实验着重测定上述肝纤维化四项指标和肝组织中的HYP 含量，研究发现，模型组大鼠血清中的HA、PC-Ⅲ、Col-Ⅳ含量和肝组织HYP 含量显著升高，表明引起大鼠肝组织损伤及肝纤维化。给予蒙古扁桃不同极性部位干预后，蒙古扁桃各部位提取物血清中的HA 含量显著降低，蒙古扁桃石油醚部位和正丁醇部位PC-Ⅲ含量显著降低，起到减轻大鼠肝细胞坏死和纤维组织沉积程度作用，说明蒙古扁桃药材石油醚和正丁醇部位是抑制 CCl4诱导大鼠肝纤维化的优选有效部位。

为了进一步深入探索蒙古扁桃药材抗纤维化的作用机制，本实验通过研究实验样品中TGF-β1、Smad3、Smad7 等蛋白的表达水平，从调节TGFβ1/Smad 信号通路的角度来研究其抗纤维化机制。目前公认的肝纤维化信号转导通路中TGF-β1/Smad信号传导通路是研究比较多、是比较深入的一条经典肝纤维化通路[29]。TGF-β 共有3种：TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，其中肝脏中含量最高且具有生物活性的是TGF-β1，与受体结合后活化并将信号向细胞内转导[35−36]。而TGF-β1 作为目前已发现的最强促肝纤维化因子，可通过Smad 蛋白转导信号进而活化肝星状细胞（HSC，Hepatic stellate cell），并促使其大量分泌胞外基质，该过程是肝纤维化发生、进展，甚至肝硬化形成的核心，故抑制TGF-β1/Smad 信号通路是缓解肝纤维化的关键[37]。由此可知，TGF-β1 是HSC活化的重要中间体，是最重要的前体。据文献报道，Schnabl 等向敲除Smad3基因的鼠胃内注射CCl4，发现该敲除鼠的α1 胶原蛋白增加，但是HSC 内不能形成TGF-β诱导的Smad 与DNA 结合形成复合物，可见Smad3 在HSC 的活化和胶原蛋白合成中起到关键作用[35]。文献报道，通过抑制TGF-β/Smad信号通路可以明显减轻肝纤维化的症状[38−40]。本实验研究发现，在CCl4诱导的大鼠肝纤维化体内，TGF-β1 和Smad3 的表达明显上调，表明肝细胞中TGF-β1/Smad 信号通路被激活，从而促进肝纤维化进程，而给予蒙古扁桃药材干预后，蒙古扁桃石油醚和正丁醇部位组TGF-β1、Smad3 的表达明显下调，说明蒙古扁桃可以通过抑制Smad3 的磷酸化水平和TGF-β1 的活性，从而调控肝星状细胞的活性，起到抑制肝纤维化作用，其机制可能是通过对TGFβ纤维化通路的调节来起到抗纤维化作用。

综上所述，蒙古扁桃药材石油醚、正丁醇提取物可以明显改善肝纤维化大鼠的组织病理学变化，对AST、ALP、SOD、MDA 等指标和纤维化四项指标HA、PC-Ⅲ的水平及HYP 水平有明显改善作用，并对TGF-β1、Smad3 水平有显著改善作用，说明该药材具有明确地抗肝纤维化作用。蒙古扁桃药材石油醚、正丁醇提取物是保护肝纤维化的优选活性部位，其抗纤维化作用机制可能与调节胶原合成异常及抑制TGF-β1/Smad 信号通路作用有关。