基于网络药理学分析咖啡酰奎宁酸类化合物治疗II型糖尿病的作用机制

李玲玉，朱文卿，朱姗姗，张 利，张 鹏，郑振佳,*

（1.山东农业大学食品科学与工程学院，山东省高校食品加工技术与质量控制重点实验室，山东泰安 271018；2.山东中平药业有限公司，山东临沂 273300）

糖尿病属于内分泌代谢紊乱疾病[1]，国际糖尿病联合会估计2019年全球有4.63 亿糖尿病患者，预计到2045年全球糖尿病患者将达到7 亿[2]。糖尿病可分I 型和II 型糖尿病，其中II 型糖尿病患者约占该病的90%[3]，其发病原因主要是由于遗传基因和不良的生活方式，尚无法根治[4]。II 型糖尿病可引起多种并发症，导致血管受损并危及心、脑、肾等，严重危害人体健康，造成巨大的社会和经济负担[5−6]。目前对II 型糖尿病患者主要采取口服降糖药物、皮下注射胰岛素、饮食控制和运动锻炼等方式调节血糖[7]。从天然植物中寻找安全性高、副作用小的潜在功能成分成为食品营养健康的研究热点[8]。

咖啡酰奎宁酸类化合物是植物体内重要的次生代谢产物，具有抗氧化、抗菌消炎、降血糖、降血压等多种生物学活性[9]。研究表明咖啡酰奎宁酸类化合物能够通过改善胰岛素抵抗及调节人体对葡萄糖的吸收起到降血糖的作用[10−11]，可用于治疗II 型糖尿病，但该类化合物治疗II 型糖尿病的主要有效成分、作用靶点和作用机制尚不清楚。

网络药理学融合了计算机科学、生物学、药理学等多个学科，通过生物网络模型分析活性成分-靶点-疾病间复杂的互作关系，可揭示活性成分与机体相互作用机制[12]。分子对接是依据酶的锁-钥匙原理，从已知结构的化合物及蛋白出发，通过计算机模拟、化学计量学计算，识别并预测受体-配体结合的方法，预测蛋白质复合物结构和结合位点[13−14]。计算机辅助技术为研究药用植物治疗疾病多成分、多靶点、多途径效应机制提供了便利。本研究基于网络药理学方法，预测咖啡酰奎宁酸类化合物作用靶点及作用机制，为II 型糖尿病的临床饮食干预治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 咖啡酰奎宁酸类化合物对应靶点预测

通过PubChem 及ChemDraw Ultra 8.0.3 软件获取咖啡酰奎宁酸类化合物的SMILES 结构，将化合物的SMILES 结构分别输入SwissTargetPrediction数据库，获取化合物的预测靶点信息。

1.2 II 型糖尿病相关靶点的检索

通过Pubmed、Ctd、DrugBank 及Genecards 等数据库检索II 型糖尿病英文名“type II diabetes”，获得与II 型糖尿病相关的作用靶点，将所得靶点去除重复项后得到II 型糖尿病相关靶点。

1.3 咖啡酰奎宁酸类化合物治疗II 型糖尿病的关键靶点网络构建

将“1.1”所得咖啡酰奎宁酸类化合物对应靶点与“1.2”所得II 型糖尿病相关靶点进行交集，得到交集靶点，获取咖啡酰奎宁酸类化合物治疗II 型糖尿病的作用靶点。将交集靶点通过STRING 数据库构建蛋白互作用（PPI）网络，通过Cytoscape 构建咖啡酰奎宁酸类化合物治疗II 型糖尿病的关键靶点网络。

1.4 GO 功能分析及KEGG 通路富集分析

借助WebGestalt 数据库对关键靶点进行GO功能分析，其包括对生物过程（biological processes，BP）、细胞组分（cell component，CC）及分子功能（molecular function，MF）的分析。利用Cytoscape软件中的ClueGo 插件对关键靶点进行KEGG 通路富集分析，选取富集基因数排名前20 的通路，通过omicshare 数据库绘制气泡图。

1.5 分子对接

采用AutoDock Vina 软件对咖啡酰奎宁酸类化合物治疗Ⅱ型糖尿病中前3 的靶点蛋白与关键成分进行分子对接验证。通过RCSB PDB（http://www.rcsb.org/）数据库获取靶点蛋白晶体结构，再利用AutoDock 对接软件对蛋白晶体结构去水加氢、计算电荷、去除原配体，对配体分子通过Torsion Tree 进行调整，运用AutoDock Vina 软件计算其对接活性位点、结合能及均方根偏差（RMSD），最后将对接结果进行可视化分析。

2 结果与分析

2.1 咖啡酰奎宁酸类化合物对应靶点预测

咖啡酰奎宁酸类化合物是由奎宁酸和不同数目的咖啡酰基通过酯化反应缩合而成，根据咖啡酰基结合数目的不同，可分为单咖啡酰奎宁酸、二咖啡酰奎宁酸和多咖啡酰奎宁酸[15]。天然植物中提取分离得到的咖啡酰奎宁酸通常是以上述化合物共存的形式存在，天然植物药理活性的发挥得益于其同分异构体的同时存在。该类化合物主要含有酯键、不饱和双键、邻二酚羟基、羟基等，尤其是酚羟基具有很好的清除自由基的能力，有助于降糖活性的发挥[16]。现已知咖啡酰奎宁酸类化合物共38 个，利用SwissTarget-Prediction 数据库预测获得化合物的对应靶点有483个。通过Cytoscape 软件对上述活性化合物与预测靶点进行关系网络的绘制和分析，得到“咖啡酰奎宁酸类化合物-靶点”网络图，如图1所示。38 种咖啡酰奎宁酸类化合物网络靶点分析顺序如下：1-O-咖啡酰奎宁酸（C1）、3-O-咖啡酰奎宁酸（C2）、4-O-咖啡酰奎宁酸（C3）、5-O-咖啡酰奎宁酸（C4）、3-O-咖啡酰奎宁酸甲酯（C5）、3-O-咖啡酰奎宁酸乙酯（C6）、3-O-咖啡酰奎宁酸丁酯（C7）、4-O-咖啡酰奎宁酸甲酯（C8）、4-O-咖啡酰奎宁酸丁酯（C9）、5-O-咖啡酰奎宁酸甲酯（C10）、5-O-咖啡酰奎宁酸丁酯（C11）、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸（C12）、1,4-O-二咖啡酰奎宁酸（C13）、1,5-O-二咖啡酰奎宁酸（C14）、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸（异绿原酸A）（C15）、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸（异绿原酸B）（C16）、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸（异绿原酸C）（C17）、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯（C18）、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯（C19）、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯（C20）、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸乙酯（C21）、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸丁酯（C22）、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸丁酯（C23）、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸异丁酯（C24）、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸乙酯（C25）、1,5-O-二咖啡酰-3-O-（4-苹果酰）-奎宁酸（C26）、1,5-O-二咖啡酰-3-O-（4-苹果酸甲酯）-奎宁酸（C27）、1,5-O-二咖啡酰-3-O-（4-丙二酰）-奎宁酸（C28）、1,5-O-二咖啡酰-3-O-琥珀酰奎宁酸（C29）、1,5-O-二咖啡酰-4-O-琥珀酰奎宁酸（C30）、1,5-O-二咖啡酰-4-O-琥珀酸甲酯奎宁酸（C31）、1,4-O-二咖啡酰-3-O-琥珀酰甲酯奎宁酸（C32）、1,3-O-二咖啡酰-4-O-苹果酰奎宁酸（C33）、1,3,5-O-三咖啡酰奎宁酸（C34）、1,4,5-O-三咖啡酰奎宁酸（C35）、3,4,5-O-三咖啡酰奎宁酸（C36）、3,4,5-O-三咖啡酰奎宁酸甲酯（C37）、1,3,4,5-O-四咖啡酰奎宁酸（C38）。

图1 “咖啡酰奎宁酸类化合物-靶点”网络图Fig.1 Network diagram of "caffeoylquinic acids-target"

2.2 II 型糖尿病相关靶点的检索

通过检索Pubmed、Ctd、DrugBank 及Genecards等数据库共获得II 型糖尿病相关靶点2214 个。

2.3 咖啡酰奎宁酸类化合物治疗II 型糖尿病的关键靶点网络构建

将咖啡酰奎宁酸类化合物的潜在作用靶点与II 型糖尿病相关靶点取交集，共得到211 个交集靶点，作为咖啡酰奎宁酸类化合物治疗II 型糖尿病的作用靶点。借助STRING 数据库及Cytoscape 软件的MCODE 插件共筛选出37 个关键靶点，并绘制出咖啡酰奎宁酸类化合物治疗II 型糖尿病的关键靶点网络，如图2所示。此网络包括37 个关键靶点，518 条相互关系，其中节点越大表明其在网络中的作用越大[17]，由此推断AKT1、MMP2、MMP8、HIF1A、IGF1R、MAPK8 等靶点蛋白可能在II 型糖尿病的治疗中起关键作用。

图2 咖啡酰奎宁酸类化合物治疗II 型糖尿病的关键靶点网络Fig.2 Key target network of caffeoylquinic acids in the treatment of type II diabetes

咖啡酰奎宁酸类化合物治疗II 型糖尿病的37 个关键靶点信息如表1所示。从表1可以看出，这些靶点与细胞的增殖分化、基因的转录调节、蛋白质磷酸化等生物学功能及调控葡萄糖代谢、调节胰岛素受体等生物过程密切相关。糖尿病发病涉及体内多个生物过程的异常，咖啡酰奎宁酸类化合物可能是通过多靶点、多通路调节这些生物过程来发挥其抗糖尿病作用。

表1 咖啡酰奎宁酸类化合物治疗II 型糖尿病的37 个关键靶点信息表Table 1 37 key targets information table of caffeoylquinic acids in the treatment of type II diabetes

续表1

2.4 GO 功能分析及KEGG 通路富集分析

对37 个关键靶点进行GO 功能分析，分析结果如图3所示。结果显示这些靶点主要参与代谢过程（metabolic process）、应激反应（response to stimulus）、生物调节（biological regulation）等生物过程，涉及细胞膜（membrane）、细胞核（nucleus）、腔上包膜（membrane-enclosed lumen）等细胞组成，以及蛋白结合（protein binding）、离子结合（ion binding）、转移酶活性（transferase activity）等分子功能。

图3 咖啡酰奎宁酸类化合物治疗II 型糖尿病的关键靶点GO 分析Fig.3 GO analysis of key targets of caffeoylquinic acids in the treatment of type II diabetes

对37 个关键靶点进行KEGG 通路富集分析，富集基因数排名前20 的信号通路如图4所示。结果表明咖啡酰奎宁酸类化合物治疗II 型糖尿病的作用机制主要涉及细胞外基质降解（Degradation of the extracellular matrix）、基质金属蛋白酶的激活（Activation of Matrix Metalloproteinases）、胶原蛋白降解（Collagen degradation）、MyD88 独立TLR3/TLR4 级联（MyD88-independent TLR4 cascade）等多条通路，主要涉及AKT1、MMP3、MMP9、HIF1A、IGF1R、MAPK8 等靶点基因，这些基因主要通过调控葡萄糖代谢以及调节相关蛋白质发挥作用。与通路相关的基因如表2所示，通路与其相关靶点之间的相互关系如图5所示。

图4 咖啡酰奎宁酸类化合物治疗II 型糖尿病的关键靶点KEGG 通路富集分析Fig.4 KEGG pathway enrichment analysis of key targets of caffeoylquinic acids in the treatment of type II diabetes

结合表2与图5可以看出，细胞外基质降解（Degradation of the extracellular matrix）主要涉及CASP3、MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP9、PLG 共7 个靶点蛋白，其中CASP3 是caspase 级联激活下游的关键成分，可防止细胞因子诱导的β细胞凋亡，这可能有助于保护糖尿病患者免受β细胞死亡[18]；MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP9 主要通过降解多种细胞外基质及相关蛋白发挥作用；PLG 则可以调控细胞增殖。基质金属蛋白酶的激活（Activation of matrix metalloproteinases）信号通路与胶原蛋白降解（Collagen degradation）信号通路同样涉及MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP9 等靶点，表明MMPS 靶点在咖啡酰奎宁酸类化合物抗Ⅱ型糖尿病方面发挥着极其重要的作用。MyD88-independent TLR4 cascade 信号通路则主要涉及CASP8、MAPK1、MAPK14、MAPK3、MAPK8 靶点。MAPK 是一组能被不同的细胞外刺激，如激素、神经递质、细胞因子、细胞应激等激活的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，调控细胞的生长、存活及分化、对环境的应激适应、炎症反应等多种细胞生理病理过程[19]。MAPK 在炎症条件下还可以激活与胰岛素抵抗密切相关的JNK 通路和P38 通路，进而发挥治疗糖尿病的作用[20]。综上所述，一条信号通路可涉及多个基因靶点，一个基因靶点可参与多个信号通路，证实了咖啡酰奎宁酸类化合物治疗II 型糖尿病是一个涉及多靶点、多通路的复杂过程。

表2 KEGG 通路富集分析相关基因Table 2 Related genes for KEGG pathway enrichment analysis

图5 咖啡酰奎宁酸类化合物治疗II 型糖尿病的作用通路与其相关靶点网络分析Fig.5 Network analysis of the pathways of caffeoylquinic acids in the treatment of type II diabetes and their related targets

2.5 分子对接验证

为了验证咖啡酰奎宁酸类化合物预测靶点的准确性，本研究采用AutoDock Vine 软件对3 个关键成分和3 个靶点进行分子对接，以自由结合能（binding energy）作为筛选条件，结合能越小表示对接结果越好。对于多构象的对接结果，筛选出结合能最低的对接构象，如表3所示。化合物与分子靶点对接得分均大于5.0，表明分子对接结果良好，验证了网络构建预测的准确性。运用Pymol 软件，根据结合能的大小选出每个靶点蛋白对接最好的化合物进行可视化分析，结果如图6所示，其中IGF1R 与绿原酸、JAK1 与异绿原酸A 和RPS6KB1 与1,3,5-O-三咖啡酰奎宁酸均可以形成氢键，为进一步整合探析咖啡酰奎宁酸类化合物治疗II 型糖尿病提供了理论参考。

图6 IGF1R、JAK1、RPS6KB1 与3 个关键成分的最佳对接构象Fig.6 Optimal docking conformation of IGF1R,JAK1,RPS6KB1 and the three key components

表3 3 个靶点与3 个关键成分的分子对接得分Table 3 Molecular docking scores of 3 targets and 3 key components

3 讨论

本研究基于网络药理学的方法，借助相关数据库和软件对咖啡酰奎宁酸类化合物治疗II 型糖尿病的作用靶点及作用机制进行了全面系统的分析。研究结果显示，通过分析得出咖啡酰奎宁酸类化合物治疗II 型糖尿病的关键靶点有37 个，靶点与靶点之间的相互关系达518 条。其作用机制主要涉及细胞外基质降解、基质金属蛋白酶的激活和胶原降解等通路、主要涉及AKT1、MMP3、MMP9、HIF1A、IGF1R、MAPK8 等靶点，与目前研究的某些药物作用于II 型糖尿病的靶点、通路基本相符[21−24]，验证了咖啡酰奎宁酸类组分具有多成分、多靶点、多通路的特点。

王馨苑等[25]通过网络药理学结合分子对接研究了黄连素治疗II 型糖尿病的作用机制，结果显示黄连素能够通过与AKT1、MMP9 等核心靶点的稳定结合，起到治疗II 型糖尿病的作用。在机体组织缺氧时，可激活缺氧诱导因子HIF-1α，而HIF-1α表达的增多会进一步加重神经纤维的缺血缺氧，这可能为糖尿病周围神经病变的发病机制之一[26]。吕翠岩等[27]研究发现抑制糖尿病周围神经病变大鼠坐骨神经HIF-1αmRNA 的转录和蛋白的表达，可以达到治疗糖尿病的效果。MAPK 信号通路为胰岛素信号的级联通路，其可以通过多种途径调节肝脏代谢，还可以通过上调GLUT4 的表达，促进糖的吸收与利用，增加胰岛素敏感性和改善胰岛素抵抗，与葡萄糖稳态有密切的关系[28−29]。葛凌等[30]研究发现槲皮素可有效减轻大鼠外周胰岛素抵抗，其作用机制可能是槲皮素激活了胰腺组织中FGF21/MAPK 信号通路，证实了MAPK 信号通路在治疗II 型糖尿病中的作用。Li 等[31]研究发现糖尿病大鼠心肌存在明显心肌纤维化，通过硫化氢（H2S）干预后，糖尿病大鼠心肌纤维化明显减轻，心肌组织中胶原蛋白I 的表达水平显著下降，且MMP-8 蛋白表达水平也明显降低，而MMPs 的表达受MAPK 通路的调控[32]，表明H2S 改善糖尿病大鼠心肌纤维化与胶原蛋白降解以及MAPK 信号通路有关。这些研究报道表明通过网络药理学预测咖啡酰奎宁酸类化合物的作用靶点和通路具有可行性，证实了咖啡酰奎宁酸类化合物治疗II 型糖尿病具有多靶点、多通路的特点，这是传统“一药一靶点”模式难以做到的，而这也符合中药多成分、多靶点、多通路对疾病起到综合治疗作用的特点。

综上所述，本研究应用网络药理学方法预测了咖啡酰奎宁酸类化合物治疗II 型糖尿病的作用靶点及作用机制，阐明该类成分通过多靶点、多通路治疗II 型糖尿病，为进一步实验研究和临床应用提供了新思路、指明了新方向。但是网络药理学分析也存在一定的局限性，其虽然能较为系统地预测活性成分作用靶点与作用通路，但预测结果不能完全证明其正确性，其作用机制需要开展体外和体内实验进行验证。