破骨细胞建模方法的探索

杨一秋，李兰，解继胜

(1. 右江民族医学院研究生学院，广西 百色 533000；2. 右江民族医学院基础医学院组织胚胎学教研室，广西 百色 533000)

骨质疏松症是一种以骨量减少，骨骼微结构退化、脆性增加的疾病。绝经期妇女由于卵巢功能减退、雌激素水平的下降加速了骨质的流失，增加了骨折的风险[1]又称为绝经后骨质疏松症(postmenopasal osteoporosis，PMOP)。发生PMOP时破骨细胞功能活跃，又被称为高转换型骨质疏松症[2]。骨稳态取决于破骨细胞对骨骼的吸收和成骨细胞对骨骼的形成作用，这种紧密耦合过程的不平衡会导致骨质疏松症、炎性关节炎等疾病[3]。骨质疏松性骨折危害巨大，但是目前椎体成形术这种手术方式，因其创伤小，并发症低等优势对于治疗骨质疏松症致脆性骨折有一定疗效[4]。因此，调节破骨细胞和成骨细胞之间的平衡对于骨细胞生物学至关重要[5]。多项研究[6-9]主要聚焦于各种药物、蛋白等对破骨细胞的影响以及其具体机制的探究，其中关于RAW264.7细胞向破骨细胞分化的具体方法各有不同。因此，本实验的主要目的是为了探索RAW264.7细胞向破骨细胞分化的最佳条件，为后续的实验研究提供一个可靠的破骨细胞建模方法。

1 材料与方法

1.1 材料 DMEM高糖培养基(Gibco，货号C11995580BT)、FBS胎牛血清(Gibco，货号10099141C)、青链霉素双抗(Gibco，货号15140122)、胰蛋白酶-EDTA，0.25%，含酚红(Gibco，货号25200-056)、巴氏吸管、Recombinant Mouse M-CSF Protein(RD，货号416-ML-050/CF)、Recombinant MouseTRANCE/RANKL(RD，货号462-TEC-010/CF)、RAW264.7细胞(购自中科院上海细胞库)、抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP染色试剂盒(CTCC，货号JD005)、RNA提取试剂盒(AXYGEN，货号AP-MN-MS-RNA-50G AxyPrep总RNA小量制备试剂盒)、实时荧光定量PCR试剂盒(Hieff TM qPCR SYBR Green Master Mix No Rox，货号11201ES08)、倒置显微镜。

1.2 方法

1.2.1 破骨细胞诱导方法 从-80°冰箱取出RAW264.7细胞，立刻放到37°水浴锅中摇晃解冻。待冰晶融化后将细胞悬液吸至15 ml离心管中，以1000 r离心5 min后，弃掉上清，加入1 ml完全培养基，将细胞悬液转移至25 cm2培养瓶中，放入37°，5%CO2培养箱中培养24 h。待贴壁24 h后，用胰酶消化细胞按2×104个每孔、3×103个每孔分别接种到6孔板、24孔板中，待细胞贴壁24 h后，对照组加入完全培养基，实验组加入诱导液(20 ng/ml的M-CSF、50 ng/ml的RANKL)诱导培养，每隔2 d换液1次。待成功诱导出破骨细胞后进行TRAP染色，并通过实时荧光定量PCR检测活化T-细胞核因子1(NFATc1)、TRAP、基质金属蛋白酶9(MMP-9)的mRNA表达水平。

1.2.2 TRAP染色方法 CTCC TRAP染色法：24孔板中细胞培养到达指定天数后，弃掉培养基，加入1号洗涤液清洗，加入固定液室温固定5 min，然后加入2号洗涤液，清洗2次。再加入TRAP染色液37°避光孵育15 min。染色结束后，加入2号洗涤液清洗2次，于显微镜下观察并拍照。若破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶活性较低，可适当延长染色时间在显微镜下观察染色达到预期深浅。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测NFATc1、TRAP、(MMP-9)的mRNA相对表达量 6孔板中细胞培养达到指定天数后，根据试剂说明书提取总RNA，然后将RNA逆转录为cDNA并进一步扩增目的基因。逆转录条件：42℃孵育60 min，70℃加热5 min扩增条件：95℃预变性300 s；95℃变性10 s；60℃退火/延伸30 s，共40个循环，以上操作均在冰上进行。以β-actin为内参，目的基因相对表达量采用2-△△ct法。引物序列见表1。

表1 目标基因引物序列

2 结果

2.1 破骨细胞未染色的形态学观察 RAW264.7细胞在向破骨细胞分化过程中，随着诱导分化时间的不同会呈现出不同的形态。利用倒置相差显微镜观察RAW264.7细胞诱导前后，细胞形态变化情况。将RAW264.7细胞以2×104个每孔接种到6孔培养板中，经完全培养基正常培养贴壁24 h的RAW264.7细胞呈圆形，小而饱满，透光性好，边界清晰，结构完整，没有或少见触角，见图1A；经诱导分化培养基培养3 d的RAW264.7细胞，细胞变长呈梭形，头尾伸出长长的触角，见图1B；经诱导分化培养基培养4 d的RAW264.7细胞，开始相互融合形成多核细胞。单个细胞形态变得更为不规则，胞体变大，细胞四周长出多个触角，伪足增多，见图1C；经诱导分化培养基培养6 d的RAW264.7细胞，细胞融合成多个核细胞，胞质增多，细胞体积进一步增多，可见较多的破骨细胞，见图1D；如果进一步延长诱导时间如诱导8～9 d，破骨细胞胞质破裂，细胞核溶解，背景变得模糊，细胞聚集成团呈现漂浮状，见图1E、图1F。

2.2 破骨细胞TRAP染色的形态学观察 将RAW264.7细胞以3×103个每孔接种到24孔板中，培养4 d后通过 TRAP染色发现经完全培养基培养的RAW264.7细胞，不见破骨细胞，图中细胞未被TRAP着色，见图2A。经诱导分化培养基培养4 d的RAW264.7细胞，经过TRAP染色可见破骨细胞被着色，阳性率较高，见图2B、图2C、图2D。

注：A：10×；B：10×；C：20×；D：40×图2 破骨细胞TRAP染色图

2.3 实时荧光定量PCR检测NFATc1、TRAP、MMP-9的mRNA表达水平 6孔板中RAW264.7细胞经过诱导6 d后通过实时荧光定量PCR检测，发现与对照组(完全培养基组)相比，NFATc1、TRAP、MMP-9的mRNA水平均上调。NFATc1、MMP-9与对照组的差异有统计学意义(P<0.05)，但是TRAP与对照组的差异没有统计学意义(P>0.05)。结果见图3。

注：与control组相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；Releative mRNA为以control组为参照的mRNA相对表达量。图3 对照组与诱导组NFATc1、TRAP、MMP-9的mRNA表达情况

3 讨论

发生PMOP时破骨细胞功能活跃，因此，熟练掌握建立破骨细胞诱导模型的方法对于后续探索用药机制十分重要。RAW264.7细胞是小鼠巨噬细胞系，可以被诱导为破骨细胞，是实验室常用的细胞系，相比于小鼠骨髓巨噬细胞(bone marrow macrophage，BMM)，RAW264.7细胞具有在体外易于生长、经过诱导形成的破骨细胞较多、无需分离、纯化等优势。这与杨佛等[10]的研究结果一致，即骨髓单核细胞和RAW264.7细胞在50 ng/ml的M-CSF和100 ng/ml的RANKL存在的条件下经过诱导培养5 d可以见到体积较大数量较多的破骨细胞，且RAW264.7细胞诱导形成的破骨细胞更多。另外，细胞的状态也会影响破骨细胞的形成，当细胞传代过多时，细胞形态变得不规则、触角增多，分化严重时不适合诱导。研究中发现RAW264.7细胞如果只加入RANKL而不加入M-CSF将会导致诱导时间延长，若M-CSF加入过多会使细胞生长过密，即使后面再加入RANKL也无法形成破骨细胞。Song CC等[11]研究发现合适的细胞种植密度以及适宜的RANKL干预时间点都会影响破骨细胞形成的数量，这与我们实验的观点相同。所以实验开始前就确定好种板密度，并同时加入M-CSF和RANKL约4～6 d就可以诱导出破骨细胞。但是由于诱导剂的批次以及细胞培养过程中计数的误差将会导致破骨细胞出现的天数可能推迟或提前，但总体上约4～6 d可以达到满意效果。

RANKL和破骨细胞前体表面上RANK结合，通过一系列信号转导最终激活转录因子活化T细胞核因子(nuclear factor-activated T cell，NFATc1)，激活后的NFATc1从细胞质进入细胞核转录出破骨细胞特异性基因如TRAP、组织蛋白酶K(cathepsin K，CTSK)、MMP-9等[12]。NFATc1的表达对于破骨细胞的生成至关重要，即使在不存在RANKL的条件下，NFATc1在破骨细胞前体细胞中的异位表达也可以促进破骨细胞的生成[13]。本实验将RAW264.7细胞以每孔2×104个、每孔3×103个分别接种到6孔板、24孔板中，待贴壁24 h后更换为含M-CSF和RANKL的诱导培养基，诱导约4 d后，可以看到24孔培养板中出现破骨细胞。诱导约6 d后，可以看到6孔板中出现破骨细胞。经过TRAP染色发现只有诱导后的破骨细胞才能着色而未加诱导剂的细胞则不被TRAP染色。并通过实时荧光定量PCR检测NFATc1、TRAP、MMP-9的mRNA均呈现上调趋势，进一步证明破骨细胞诱导成功。

但是，由于RAW264.7细胞贴壁严重、难以消化、容易分化、诱导剂M-CSF和RANKL的价格昂贵、诱导成功的破骨细胞容易死亡等问题，在一定程度上也限制了破骨细胞研究的发展。