SEMA4D与头颈部鳞状细胞癌发生发展的生物信息学研究

石凤，王俊利，董明右，庞晓霞，李兰，李光景，杨凤莲

(1. 右江民族医学院研究生学院，广西 百色 533000；2. 右江民族医学院医学检验学院，广西 百色 533000；3. 右江民族医学院药学院，广西 百色 533000)

头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)是一种常见的头颈部恶性肿瘤，包括口腔肿瘤、口咽肿瘤、喉部肿瘤和鼻咽癌，每年约有700 000新增病例数[1]。HNSCC的早期临床症状不明显，大多数发现时已进展为中晚期，常累及淋巴结转移，HNSCC的预后较差，晚期治疗的常规手段包括手术、放化疗等[2]，对患者的身心健康产生很大的影响。轴突导向蛋白4D(semaphorin 4D，SEMA4D)属于信号素家族成员第Ⅳ类，是一种跨膜糖蛋白，大小为150 kDa。SEMA4D包含SEMA结构域，半胱氨酸富集区、免疫球蛋白结构域、跨膜区和氨基酸末端信号结构域。SEMA4D存在两个受体CD72和PlexinBi，配体与受体相结合，通过信号转导通路参与神经系统的调节、免疫细胞的活化、肿瘤新生血管的形成及促进肿瘤的生长、侵袭和迁移能力[3]。近年来，越来越多的研究表明SEMA4D在前列腺癌、乳腺癌和结直肠癌中高表达[4]。Zhang C等[5]研究发现SEMA4D通过促进HNSCC的上皮-间质细胞转化，进而促进HNSCC的转移。HNSCC是一种复杂的头颈部肿瘤，然而，SEMA4D在HNSCC中的相关性研究较少且其具体作用机制仍需进一步阐明，因此，本研究将通过来自于肿瘤基因组图谱(The cancer genome atlas，TCGA)数据库进行分析SEMA4D在泛癌中的表达、SEMA4D与HNSCC的免疫细胞浸润情况以及对HNSCC患者的生存期进行相关性分析。

1 材料与方法

1.1 数据获取 从UCSC Xena官网(https://xena.ucsc.edu/)提取HNSCC等33个肿瘤的GDC TCGA数据。所有的研究数据来源于TCGA公共数据库，该数据库数据对外开放，因此，不需要相关医学伦理委员会批准。

1.2 SEMA4D与HNSCC临床特性的相关性 通过UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/)在线数据库分析SEMA4D表达水平与HNSCC患者的肿瘤分级、淋巴结转移和HPV16感染情况的相关性。

1.3 SEMA4D与HNSCC免疫浸润细胞的相关性 输入癌症的基因转录组数据，通过R语言3.6.0的“estimate”包对HNSCC转录组数据进行免疫细胞得分，分析SEMA4D与HNSCC患者的免疫细胞得分及免疫浸润细胞[CD4+T细胞、CD8+T细胞、调节性T细胞(Treg)、自然杀伤细胞、中性粒细胞和巨噬细胞]的相关性。

1.4 Kaplan-Meier法分析HNSCC患者的生存分析 通过SEMA4D表达水平的中位值将HNSCC患者分为两组，分别为高表达SEMA4D组和低表达SEMA4D组。采用Kaplan-Meier分析SEMA4D表达水平与HNSCC患者总体生存期(患者从确诊为HNSCC开始至患者因任何原因导致死亡的时间)的关系。

1.5 统计学方法 通过Perl软件对TCGA来源的肿瘤转录组数据的基因编号转化，通过Wilcoxon检验分析SEMA4D表达水平与HNSCC患者的肿瘤分级、淋巴结转移和HPV16感染是否有关；通过Spearman相关性检验计算SEMA4D表达水平与HNSCC免疫细胞得分和免疫浸润细胞的相关性；通过Kaplan-Meier法分析SEMA4D表达水平与HNSCC患者总体生存期是否有关，本研究检验结果均通过R语言3.6.0软件分析计算所得。P<0.05表明差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 SEMA4D在肿瘤组织中的表达 将下载的GDC TCGA转录组数据，通过Perl命令提取所需要的输入文件，包括基因名称、SEMA4D在肿瘤组织中的表达水平、组织类型和肿瘤类型。通过R语言3.6.0 “ggpubr”包对SEMA4D在肿瘤组织和正常组织中的表达绘制箱线图，结果如图1所示，SEMA4D在HNSCC中的表达水平相对于正常组织降低，差异具有统计学意义(P<0.001)。

注：蓝色：SEMA4D在正常组织中的表达量；红色：SEMA4D在肿瘤组织中的表达量。*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001。图1 SEMA4D在肿瘤组织中的表达

2.2 SEMA4D与HNSCC临床特征的分层分析 以上结果显示，SEMA4D在HNSCC中的表达相对于正常组织显著降低，为了进一步探讨SEMA4D在HNSCC亚组中的相对表达信息，本研究通过UALCAN在线网站对SEMA4D表达水平与HNSCC临床特征的相关性进行分层分析。研究结果显示：SEMA4D在肿瘤分级Ⅰ级中的表达水平相对于正常组显著降低(P=0.005)，而在肿瘤分级Ⅳ中的表达水平相对于正常组显著升高(P=0.003)。由于肿瘤分级Ⅳ的样本量仅为7例，因此，平均表达水平升高具有偏倚性(见图2A)。此外，SEMA4D在HPV16感染患者中的表达水平升高，而在HPV16阴性患者中的表达水平降低。然而，SEMA4D与HNSCC患者的淋巴结转移无关，见图2B、图2C。

注：A：SEMA4D与HNSCC患者肿瘤分级的相关性分析；B：SEMA4D与HNSCC患者淋巴结转移的相关性分析；C：SEMA4D与HNSCC患者HPV16感染状态的相关性分析。图2 SEMA4D在HNSCC亚组中的表达水平

2.3 SEMA4D与HNSCC的TMB和MSI 肿瘤突变负荷(tumor mutation burden，TMB)和微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)是多种肿瘤的有效预后标志物和免疫治疗反应指标。通过分析基因在肿瘤中与TMB和MSI的相关性，以探讨基因活性与肿瘤突变的关系。通过Spearman对SEMA4D与HNSCC进行TMB和MSI分析，研究发现SEMA4D与HNSCC的TMB和MSI不具有统计学意义，表明SEMA4D与HNSCC突变可能不具有相关性，见图3。

注：A：TMB；B：MSI。图3 SEMA4D与泛癌TMB和MSI的相关性

2.4 SEMA4D与免疫细胞浸润 通过R语言3.6.0 “estimate”包计算HNSCC的免疫细胞得分，分析其与SEMA4D表达水平的相关性。研究发现：SEMA4D表达水平与HNSCC免疫细胞得分呈正相关，相关系数为0.37，见图4。进一步通过R语言3.6.0的Spearman相关性检验对SEMA4D表达水平与HNSCC免疫浸润细胞进行分析。研究发现SEMA4D表达水平与CD4+T细胞、CD8+T细胞和调节性T细胞呈正相关，而与自然杀伤细胞、中性粒细胞和巨噬细胞呈负相关，见图5。

图4 SEMA4D与HNSCC免疫细胞得分的相关性

注：A：CD4+T细胞；B：CD8+T细胞；C：调节性T细胞(Treg)；D：自然杀伤细胞；E：中性粒细胞；F：巨噬细胞。图5 SEMA4D与免疫浸润细胞的相关性

2.5 SEMA4D与HNSCC患者生存期的相关性分析 将SEMA4D在不同肿瘤中的表达水平根据均值分为两组，分别为SEMA4D高表达组和SEMA4D低表达组，采用Kaplan-Meier分析SEMA4D表达水平与HNSCC患者总体生存期的关系。结果显示：SEMA4D高表达增加HNSCC患者的总体生存期(P=0.013)，见图6。

图6 SEMA4D与HNSCC的总体生存期相关性

3 讨论

SEMA4D，也被称之为CD100，是信号素超家族的SEMA成员，最初发现于免疫细胞。SEMA4D在静息T细胞中高表达，在静息B细胞和抗原提呈细胞中低表达。研究发现，SEMA4D通过与受体CD72结合，参与免疫系统调节过程，促进B细胞和抗原提呈细胞的激活和成熟，抑制单核细胞的迁移能力。然而，SEMA4D与受体Plexin-B1结合，参与神经系统调节，调节肿瘤相关巨噬细胞，促进肿瘤新生血管的形成，为肿瘤细胞的生长提供营养物质，进而促进肿瘤细胞的生长、侵袭和迁移[6]。血管内皮生长因子(VEGF)在血管形成的生理和病理状态下都发挥着至关重要的作用，促进血管内皮细胞的生长和增殖，抑制血管内皮细胞的凋亡，维持血管的渗透脆性。Chen Y等[7]研究发现SEMA4D与VEGF表达水平呈正相关，并协同促进卵巢癌的血管形成。HNSCC排列肿瘤第六位，由于其肿瘤位置隐蔽，发病初期不易察觉，转移性高等特点，使HNSCC患者的生存率不超过50%[8]。既往研究表明[5]，上皮-间质细胞转换是肿瘤发生转移的重要标志，CD100-Plexin-B1通过激活Vav1-rac1/RhoAPAK1通路促进HNSCC上皮-间质细胞转换，导致肿瘤发生转移。另一项研究发现[9]，SEMA4D调节成骨细胞中核因子κβ配体(RANKL)受体，与胰岛素样生长因子-I(IGF-I)正向调节，促进HNSCC肿瘤的破骨形成和骨转移。然而，SEMA4D作为一种免疫相关因子，参与免疫系统的调节，SEMA4D是否通过促进肿瘤免疫逃逸进而导致HNSCC的发生，以及SEMA4D与HNSCC患者的预后仍需进一步阐明。

本研究通过生物信息学研究发现SEMA4D在膀胱移行细胞癌(BRCA)、宫颈癌(CESC)、胆管癌(CHOL)、结肠癌(COAD)、肺腺癌(LUAD)、前列腺癌(PRAD)、直肠腺癌(READ)、子宫内膜癌(UCEC)等肿瘤中高表达，然而在胶质母细胞瘤(GBM)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、肾细胞癌(KICH)、肾透明细胞癌(KIRC)和甲状腺癌(THCA)中低表达。该研究结果与Zhang C等[5]和Takada H等[9]的研究结论相反。通过UALCAN在线数据库进一步分析SEMA4D与HNSCC患者的肿瘤分期、淋巴结转移和HPV16感染情况的相关性，研究发现SEMA4D表达水平与肿瘤分级呈负相关，并且降低HPV16阴性HNSCC患者中的表达水平，而与肿瘤淋巴结转移不具有相关性。在发达国家，HNSCC的发病率逐渐下降，然而，由HPV感染的HNSCC患者逐渐增加，主要类型为HPV16(70.7%)，其感染后的机体清除率最低[10]。TMB和MSI有效地反映了肿瘤的预后生物标志物和治疗指标，提示基因活性与肿瘤突变相关性。本研究未发现SEMA4D与HNSCC的TMB和MSI有关。SEMA4D作为一种免疫相关性细胞因子，来源于免疫细胞，参与免疫细胞的激活和活化，通过分析SEMA4D与免疫细胞得分和肿瘤免疫浸润细胞的相关性，研究发现SEMA4D与HNSCC的免疫细胞得分呈正相关。并与CD4+T细胞、CD8+T细胞和调节性T细胞呈正相关，而与自然杀伤细胞、中性粒细胞和巨噬细胞呈负相关。CD8+Treg细胞和CD4+Treg细胞参与机体免疫抑制能力，维持机体免疫稳态、免疫耐受和抗抑制免疫排斥反应。然而，在肿瘤中，研究发现，CD8+T/Treg细胞比例更有效判断机体免疫抑制能力，其比例增加促进肿瘤细胞发生免疫逃逸，进而引起肿瘤的发生[11-12]。因此，SEMA4D在HNSCC中的作用机制，是否与CD8+Treg细胞和CD4+Treg细胞有关，仍需深入阐明。进一步对SEM4D与HNSCC的生存期进行分析，研究结果显示，SEMA4D高表达患者的总体生存期较好。

综上所述，本研究发现SEMA4D在HNSCC患者和肿瘤分级为Ⅰ级患者中的表达水平显著降低，并与免疫细胞得分和肿瘤免疫浸润细胞相关，其表达水平越低，预后越差。该生物信息学研究表明SEMA4D在HNSCC中为保护基因，与其他研究结论存在差异。可能存在以下几点因素：第一，该研究群体均来自于TCGA数据库，可能存在基因种族人群差异，造成研究结论不一致。第二，该研究人群来源区域未知，可能存在样本选择偏倚以及环境因素影响。本文初步探讨SEMA4D在HNSCC免疫浸润细胞的相关性，SEMA4D是否直接影响CD8+Treg细胞和CD4+Treg细胞的表达水平，仍需进一步深入研究。