心叶日中花对盐和干旱胁迫的生理响应

付娆，张海洋，梁晓艳，李萌，李俊林，宋延静，李茹霞，王向誉

（山东省蚕业研究所，山东 烟台 264002）

我国盐碱地总面积约9 900万hm2，约占全国陆地面积的10.3%，主要分布在东北西部、西北、华北和滨海地区，并以每年1.5%的速度增长［1］。改造治理及合理开发利用这一重要的后备土地资源，对改善生态环境、保障我国耕地和粮食生产安全和实现农业可持续发展等具有重大意义［2］。大部分盐碱地区土壤瘠薄、水资源匮乏、盐碱化程度高、自然植被稀少、生态脆弱，众多盐碱土治理措施中通过建植适宜的耐盐碱植物来减少土壤含盐量和改善土壤结构，被认为是最具潜力且绿色的改良利用途径［3］。保护和挖掘利用耐盐碱植物种质资源，对于盐碱地改良利用具有十分重要的意义，但目前该方面研究更多集中于盐生植物资源，而对不同种类及不同耐盐碱植物资源的耐盐碱特性和利用方式的研究还相对匮乏，对其抗逆机制还知之甚少。

盐分和干旱胁迫作为盐碱地区最常见的非生物胁迫，易造成植物生理、分子和代谢水平的显著变化，严重影响植物的生长发育和产量。植物在盐、旱胁迫下体内会产生大量的活性氧（ROS），包括过氧化氢、氢氧根离子、超氧阴离子等。活性氧在体内的大量累积会对植物产生毒害作用，引起膜脂过氧化作用，导致膜选择透过性丧失，大量积累有害物质［4，5］。为了阻止过度的ROS积累对细胞的毒害作用，植物形成了一系列精细的活性氧清除系统，包括一些抗氧化酶及抗氧化物质，它们亦是反映植物抗性的重要指标［6，7］。其中最主要的抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）等，它们可以帮助细胞清除大量活性氧自由基，降低其对膜系统造成的伤害［8，9］。丙二醛（MDA）是膜脂过氧化的最终产物，其含量高低能反映膜脂过氧化作用的强弱和受伤害程度的大小，可将其作为衡量植物抗旱耐盐性的重要指标之一［10］。植物在遭受逆境胁迫时通过主动积累渗透调节物质来提高细胞液浓度，维持细胞膨压和细胞内生理过程的正常进行，其中可溶性蛋白是植物调节自身细胞渗透势的重要物质之一，其含量高低直接影响植物对水分的吸收与利用［11］。

心叶日中花，又名穿心莲，原产南部非洲，中国引进栽培。它为多年生常绿草本，既能赏花又能观叶，适合户外造景及室内绿化；亦是一种高产高效的绿叶蔬菜，其嫩茎叶具有独特的口感和较高的营养价值，是一种极具发展潜力的新兴蔬菜，市场前景广阔［12］。心叶日中花与耐旱耐盐碱蔬菜——冰叶日中花（别名“冰菜”）同属于番杏科日中花属，对于盐胁迫有较快的反应机制，有较强的耐盐性，属于较耐盐植物［13］。前期引种栽培中发现，心叶日中花具有很强的耐旱性，持续干旱胁迫下植株茎秆老化枯萎并提早进入生殖生长状态，但在水分供应恢复后，植株能恢复到营养生长状态。鉴于此，本研究将心叶日中花作为盐碱地改良利用的一个耐盐碱植物种质资源，以其扦插苗为试材，设置NaCl溶液（模拟单盐胁迫）、海水（模拟复合盐胁迫）和PEG－6000（模拟干旱胁迫）处理，测定其在不同胁迫时间下叶片的SOD、POD、CAT活性，以及MDA、可溶性蛋白含量的变化情况，研究其耐盐抗旱生理机制，以期为该植物盐碱地种植及产量提高提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与胁迫处理

剪取长势良好且大小一致的心叶日中花嫩枝，扦插于装有珍珠岩的穴盘中，再放在人工气候箱中进行培养。培养温度为（22±3）℃，光照强度为30～40μmol／（m2·s），光周期为14 h光照／10 h黑暗。3周后待其根系生长良好时，进行盐胁迫和干旱处理，分别设对照组（CK）：用蒸馏水浇灌；单盐胁迫组（NaCl）：用300 mmol／L NaCl溶液浇灌；复合盐胁迫组（MW）：用18‰盐浓度海水（天然海水与蒸馏水混合）浇灌；干旱胁迫组（PEG）：用30% PEG－6000溶液浇灌。每处理重复3次。分别于处理后0、1、2、3 d和7 d取样。取样时选取长势相同的3～5片叶，包于标记好的锡箔纸中，随即放入液氮中冷冻固定，置于－80℃超低温冰箱中保存。待样品全部取完后进行生理指标测定。

1.2 生理指标测定

酶液制备：称取0.5 g叶片于－20℃预冷的研钵中，加入4℃预冷的0.05 mmol／L磷酸缓冲液（pH＝7.8）5 mL冰浴研磨，然后10 000 r／min离心20 min，取上清液，4℃下保存。

酶活性测定：超氧化物歧化酶（SOD）活性测定采用氮蓝四唑法［14］；过氧化物酶（POD）活性测定采用愈创木酚法［15］；过氧化氢酶（CAT）活性测定参照王学奎等［16］的方法；丙二醛（MDA）含量测定采用硫代巴比妥酸法［17］；可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝比色法［14］。所有样品的吸光度值均用岛津UV－2550紫外可见光光度计进行测定。

1.3 数据处理与分析

采用Microsoft Excel 2010整理数据并绘制图表，SPSS 20软件进行方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 盐和干旱胁迫对心叶日中花超氧化物歧化酶活性的影响

由图1可见，心叶日中花叶片超氧化物歧化酶（SOD）活性，对照0～7 d间无显著变化（P＞0.05）。单盐（NaCl）处理，随胁迫时间延长叶片SOD活性总体呈先升高后下降趋势，与0 d相比，胁迫1、2、3 d时SOD活性分别升高18.41%、10.31%和15.47%，7 d时SOD活性下降16.48%。复合盐（海水）胁迫处理1 d时SOD活性最高，比0 d升高71.99%，随后活性降低但仍高于0 d，2、3 d和7 d时分别比0 d升高23.15%、39.10%和24.49%。PEG胁迫处理，SOD活性总体呈先升高后下降的趋势，3 d时SOD活性最高，与0 d相比升高44.70%。

图1 不同处理心叶日中花叶片SOD活性变化

2.2 盐和干旱胁迫对心叶日中花过氧化物酶活性的影响

由图2可见，心叶日中花叶片过氧化物酶（POD）活性，对照0～7 d间无显著变化（P＞0.05）；盐和干旱胁迫下，不同处理天数的POD活性与0 d相比差异显著（P＜0.05）。单盐（NaCl）处理，随胁迫时间延长，POD活性总体呈先升高后下降趋势，与0 d时相比，1、2、3 d和7 d时分别升高72.70%、42.43%、33.55%和23.36%。复合盐（海水）胁迫后，POD活性呈先上升后下降趋势，与0 d时相比，1、2、3 d和7 d分别升高90.49%、52.11%、39.79%和40.49%。PEG胁迫处理下，POD活性呈逐渐升高趋势，与0 d时相比，1、2、3 d和7 d分别升高33.33%、31.87%、54.21%和56.41%。

图2 不同处理心叶日中花叶片POD活性变化

2.3 盐和干旱胁迫对心叶日中花过氧化氢酶活性的影响

由图3可见，心叶日中花叶片的过氧化氢酶（CAT）活性，对照0～7 d间无显著变化（P＞0.05）。单盐（NaCl）处理，随胁迫时间延长，CAT活性总体呈先升高后下降趋势，1 d时活性最高，与0 d相比升高152.0%；1 d后酶活性开始下降，至7 d时与0 d相近。复合盐（海水）胁迫处理后，CAT活性总体呈先缓慢上升后下降趋势，与0 d时相比，1、2 d和3 d分别升高123.81%、138.10%和71.43%，7 d时活性略低于0 d。PEG胁迫处理后，CAT活性总体呈先上升后下降趋势，与0 d时相比，1、2 d和3 d分别升高43.48%、86.96%和69.57%，7 d时活性略低于0 d。

图3 不同处理心叶日中花叶片CAT活性变化

2.4 盐和干旱胁迫对心叶日中花丙二醛含量的影响

由图4可见，心叶日中花叶片丙二醛（MDA）含量，对照0～7 d间无显著变化（P＞0.05）；盐和干旱胁迫下，不同处理天数的MDA含量均高于0 d（P＜0.05）。单盐（NaCl）处理，随胁迫时间延长，MDA含量呈现明显持续上升趋势，处理1、2、3 d和7 d时分别比0 d上升123.07%、154.59%、138.20%和165.67%。复合盐（海水）胁迫处理后，MDA含量总体呈逐渐升高趋势，1、2、3 d和7 d时分别比0 d上升184.69%、243.52%、268.39%和277.58%。PEG胁迫处理后，MDA含量亦呈逐渐升高趋势，1、2、3 d和7 d时分别比0 d上升160.95%、166.32%、155.16%和177.86%。

图4 不同处理心叶日中花叶片MDA含量变化

2.5 盐和干旱胁迫对心叶日中花可溶性蛋白含量的影响

由图5可见，心叶日中花叶片可溶性蛋白含量，对照0～7 d间无显著变化（P＞0.05）；盐和干旱胁迫下，不同处理天数的可溶性蛋白含量均高于0 d。单盐（NaCl）处理，随胁迫时间延长，可溶性蛋白含量呈先升后降趋势，1、2、3 d和7 d时分别比0 d升高139.67%、52.89%、33.06%和68.60%。复合盐（海水）胁迫处理后，可溶性蛋白含量总体呈先升后降趋势，1～3 d显著增加，7 d时则趋近于0 d。PEG胁迫处理后，可溶性蛋白含量同样呈先升高后下降趋势，1、2、3 d和7 d时分别比0 d升高209.60%、225.60%、143.20%和119.20%。

图5 不同处理心叶日中花叶片可溶性蛋白含量变化

3 讨论与结论

在环境胁迫下，植物可以维持较高水平的抗氧化酶活性，消除活性氧自由基以减少其伤害［18］。MDA是膜脂质过氧化的产物，与膜渗透性密切相关，膜脂过氧化可增加膜的通透性并促进水解作用，从而增加电导率［19］。有研究表明，PEG－4000模拟干旱和NaCl胁迫条件下，马铃薯试管苗SOD和CAT活性显著增强，其MDA含量迅速增加，一定程度上缓解了干旱和高盐胁迫的伤害［20］。盐胁迫下，冰叶日中花叶片中的SOD和CAT活性均表现出上升趋势，因此推测抗氧化酶降低细胞内的过氧化作用，提高冰叶日中花的耐盐性［21］。虽然植物在受到胁迫时能够启动自身的酶系统来抵御不良环境，但也仅限于一定的胁迫范围内，当盐胁迫浓度过大时，酶活性下降，从而对植物造成伤害［6］。本试验中，在NaCl、海水和PEG胁迫下，心叶日中花叶片SOD、POD和CAT活性显著增加，表明这三种酶都参与了活性氧清除，以抵抗离子毒害和失水伤害；但当胁迫时间持续增加时，叶片SOD、POD和CAT活性下降，而丙二醛含量则呈显著上升趋势。这些结果表明，植物的抗氧化系统在长时间缺水和高盐胁迫环境下，体内SOD、POD和CAT活性的增加还不足以消除过量的ROS，从而诱发植物叶片活性氧的积累，造成氧化胁迫，引起膜脂过氧化反应，MDA大量产生，细胞膜损伤。

可溶性蛋白是植物重要的渗透调节物质和营养物质，能提高细胞的保水能力，对细胞的生命物质及生物膜起保护作用，植物通过累积可溶性蛋白使渗透势降低的方式来进行渗透调节，缓解盐或干旱胁迫导致的离子毒性和生理干旱［22，23］。本试验结果发现，当受到NaCl、海水和PEG胁迫时，心叶日中花叶片的可溶性蛋白含量均先显著增加，表明在逆境条件下新的蛋白质被诱导合成，并参与到细胞渗透调节以及增强保护酶、渗透调节物质合成酶的活性，继而提高细胞的保水能力，使细胞内外的水分达到一个平衡状态，来消减盐和干旱胁迫对细胞造成的损害。但长时间受到盐和干旱胁迫时，可溶性蛋白含量开始下降，表明心叶日中花的渗透调节能力受到抑制，无法合成新的可溶性蛋白，植物无法通过自身调节来消除逆境伤害。

本试验分别用NaCl和海水模拟单盐和复合盐胁迫，发现两种胁迫所引起的SOD、POD、CAT活性升高，MDA含量增加以及可溶性蛋白含量的变化趋势是一致的，但海水胁迫下植物叶片的这些生理响应要迟于NaCl胁迫。如：NaCl胁迫后SOD活性迅速增加，1 d时达到最大值，2～7 d活性值与1 d时相比呈下降趋势；但海水胁迫下1～3 d缓慢增加至活性最大值，然后再呈下降趋势。产生这种现象的原因可能是，NaCl单盐溶液会对植物生长产生强烈抑制作用甚至是毒害效果，即单盐毒害，而海水中除了Na＋还有其它一些阳离子，如K＋等，产生了离子拮抗作用，从而减缓盐胁迫作用［24］。

综上所述，心叶日中花在遭受高盐和干旱胁迫时，超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶活性增强，丙二醛含量大量积累，渗透调节物质可溶性蛋白含量明显增加，使高盐和干旱逆境对植株损害降到最低，表现出一定程度的盐和干旱胁迫耐受性。但长时间暴露于高盐和干旱逆境中时，植株体内抗氧化酶活性的增加量不足以消除过量ROS时，植物的自我调节能力丧失，活性氧产生和清除的动态平衡被打破，活性氧在细胞内大量积累，导致膜脂过氧化，膜功能受损，植物生长受到抑制。今后，在本试验结果的基础上，我们将进一步探讨心叶日中花抗盐耐旱的生理和分子机制，更广泛地调查收集保存和评价耐盐碱植物品种，研究其耐盐范围和耐盐机理，以便能搭配合理的耕作栽培措施，综合改良利用盐碱地。