Cofilin在鸭肠炎病毒感染过程中的影响研究

张杨子 王璇 吴珇彤 潘淑惠 文正常 文明

（1，贵州省畜牧兽医研究所 550001；2，贵州大学 550001）

鸭病毒性肠炎（DVE）指的是鸭肠炎病毒（DEV）引发的禽类急性、热性、败血性传染疾病，以往在多个国家流行，其给养鸭业造成了相当大的经济损失[1]。丝切蛋白（Cofilin）为一类低分子量肌动蛋白结合蛋白物质，其广泛存在于真核生物内。Cofilin 具体的活性会受到诸多因素调节，体现出与之相关的作用。结合实际情况，本文全面探究Cofifilin 在鸭肠炎病毒感染过程中的影响。

1 材料与方法

1.1 一般资料

试验应用的受精鸭蛋购买自某地养殖场。选择国家动物疫病研究室内提供的鸭肠炎病毒G Z 株为病毒菌株。自中国上海吉玛生物有限公司购买pGPH1/GFP/Neo-shNC 表达质粒。本试验所使用的试剂为胎牛血清、DMEM、胰蛋白酶、Penicillin streptomyin、Lipofectamine3000。试验所使用的主要仪器：倒置型荧光相差显微镜及与之相关成像系统、孵化机。

1.2 方法

1.2.1 Cofilin-shRNA 提取

首先，依照测序得出的鸭源的-Cofilin2 基因全序列，应用在线软件，选择鸭源Cofilin2RNA 的相关干扰性靶点，设计出相关干扰序列，送到中国上海吉玛生物有限公司完成合成工作。在shRNA 模板内的loop 结构择取TTCAAGAGA，以防止生成终止性信号，运用T6 结构为RNA 转录终止序列。并于正义链模板5’ 端增添CACC，保证其和BbsI 酶切后生成粘端互补。并在反义链5’ 端增加GATC。若siRNA 首个碱基并非G，有必要于CACC 后增加G。同时设立阴性对照小组。然后，试验应用ddH2O，把已经合成完毕的寡聚单链DNA 溶解为100μm/L。在互补型单链之内分别取用5μl，双双混合，并加入共计2μl 的10×oilgo annealing buffer。加入纯净水，直至20μl为止。此后把以上物质加热到95℃，共计5min。室温冷却，最终生成双链样DNA，此后稀释为10nM/L 的溶液。依照相关次序，分 别加5×ligation buffer、pGPH1/GFP/Neo、ds-oligo 及T4DNAliase。加入纯净水，直至20μl，并在室温环境下放置0.5h。最后，选择10μl 的连接产物，全面转化感受态细胞DH5α。将其涂抹在含有壮观霉素的LB 平板中，将其放入37℃环境下过夜。将单克隆菌落接种在内含壮观霉素LB 培养基内恒温过夜，提取质粒。将其送到有资质公司内完成测序工作。

1.2.2 Cofilin-shRNA 相关筛选

首先，重组质粒转染DEF 原代细胞，具体为提取重组质粒、制备DEF 原代细胞及重组质粒转染。然后在转染24h 后应用显微镜查看GFP 表达详情及细胞生长详情。目的在于实施miRNA 的筛选工作。最后，应用FQ-PCR 测定细胞Cofifilin 基因转录水平。在转染完毕24 h 后收集好细胞，并提取总RNA后开展反转录工作，制作成cDNA，实施CofifilinFQPCR 测定出共计4 小对miRNA 的影响效果详情。

2 结果

2.1 Cofilin-shRNA 染色表达结果

培养所得的DEF 细胞表现为单层后，实施转染RNA 对质粒加以干扰。24h 内查看重组质粒转染详情。结果表明细胞生长满意，因重组质粒内包含GFP 基因，所以被转入细胞显示出绿色荧光，证实转染重组质粒试验成功。

2.2 Cofilin-shRNA 影响观察结果

每个小组均可以测得Cofilin 基因。空白组Cofilin 水平峰值为1。阴性组实际含量水平高于质粒小组，但比空白组低。转染后重组质粒Cofilin-shRNA-304 及86 后细胞的转录水平比空白小组低。Cofilin-shRNA451、247 细胞的Cofilin 转录水平比空白组低，但并不明显。在此其中Cofilin-shRNA86 经处理后细胞内部Cofilin 转录量最小，其沉默效果峰值达到54.03%，表示其针对于细胞的Cofifilin 沉默效果最为优秀，可以供给后续试验应用。

2.3 Cofilin-shRNA 干扰下DEV 增值动态详情

转染处理后RNA 干扰质粒后相关时间段内Cofilin mRNA检测结果，见表1。转染靶向miRNA 后感染DEV 动态性测定DEV 核酸水平，见表2。

表1 转染处理后RNA 干扰质粒后相关时间段内Cofilin

表2 转染靶向miRNA 后感染DEV 动态性测定DEV 核酸水平

3 讨论与结论

就Cofilin 具体功能分析，Cofilin 能和肌动蛋白丝及肌动蛋白单体相互结合体现出作用[2]。其于细胞中结合肌动蛋白丝主要通过内部不稳定性解聚加以实现。同时，其也能有效抑制肌动蛋白单体聚合，加大激动蛋白丝翻转。相关调查表明，Cofilin 为细胞运动能力调控过程中的重要因素之一，其能有效维持细胞极性和具体形态，加速胞质分裂，促进细胞游走及运动，参加到胚胎的血管新生、发育、器官形成和肿瘤转移等功能中[3]。

在所有生物调节过程内，转录调控均显得格外重要。应用RNA 干扰技术能以特异性的方式抑制特定化基因表达，其属于一类快捷且高效的分析基因功能工具。本组试验研究结果表明，通过荧光显微镜收集图像分析，4 组质粒成功转染且顺利表达。

其中沉默率最高为Cofifilin-shRNA-86。86 对DEF 细胞转染处理后48～120h 沉默效率在42.6%～56.2%之间。其在转染DEF 细胞24h 后感染DEV，测定出DEV 在转染后24～96h 过程中的核酸量比转染DMEM 组更低。DEV 感染小组及正常小组各个组织Cofilin2 基因于相同时间点转录变化一致性强。其在相同组织各个时间段转录改变没有体现出规律。筛选获取沉默效应显著的Cofilin shRNA-86。经干扰宿主处理细胞Cofilin2 基因表达情况，表明其能达到促进DEV 增殖的效果。