液相阻断ELISA 在口蹄疫抗体检测中的应用
2021-07-16陶天宇李道勇
陶天宇 李道勇
(1,安徽省宣城市郎溪县农业农村局动物疫控中心 241000;2,华益药业科技(安徽) 有限公司 230000)
口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV) 引起的,在偶蹄动物之间传染的烈性传染病,以牛、猪最易感,羊、骆驼、象等均有累计发病报告。该病分为O 型、A 型、C 型、南非I 型、亚洲I 型等7 种血清型,其中以O 型和A 型分布最广,危害最大。是农业农村部规定的一类动物传染病。当养殖羊患有口蹄疫病时,其口蹄部出现大量水泡,水泡出现后2~3d 开始溃烂,并导致周围组织化脓。患病羊蹄部出现站立不稳、打颤、行走姿态异常等现象,口部有黏稠性涎流出,流淌速度较慢呈淡青色,与正常反刍流涎略有差别。同时,病羊出现食欲下降、急躁等情况。
本次试验主要采取液相阻断ELISA 法追踪检测郎溪某羊羊牲畜养殖家庭农场养殖的湖羊O 型口蹄疫免疫抗体滴度。通过利用口蹄疫病毒O 型抗体会与包被板上的重组抗原和抗羊二抗酶标结合物特异性结合,以及抗羊二抗酶标结合物底物反应显色原理反映出待测血清中口蹄疫病毒O 型抗体情况[1]。为监管基层国家强制免疫计划工作开展,保证养殖场健康发展提供坚实数据支撑,现将检测应用报告情况汇报如下。
1 材料与方法
1.1 检测样品
郎溪县某羊羊牲畜养殖家庭农场湖羊群经口蹄疫O 型灭活疫苗(JYBL-2014-5-21)免疫的湖羊血清样本214 份。
1.2 试验器材
波长450nm 和630nm 酶标仪、37℃恒温箱;1~10μl 移液器,10.0~100.0μl 移液器和100.0~1000.0μl12 道移液器若干;配套移液器尖若干;移液槽若干;吸水纸若干;1000ml 量筒一个,1000ml 烧瓶2 个;此次检测试剂盒系采用中国农业科学院兰州兽医研究所生产的改进型O 型口蹄疫液相阻断ELISA 检测试剂盒(生产批号:20200109134,抗原批号:101/24)。
1.3 试验步骤
1.3.1 羊群免疫
使用口蹄疫O 型灭活疫苗,按照产品使用说明规定免疫剂量及免疫方法对该湖羊养殖家庭农场羊群接种免疫,于2 免24d 后采血,并进行免疫效果检测[2]。
1.3.2 洗涤液准备
用蒸馏水或去离子水按1:10 稀释洗涤液(如取100ml 洗涤液,需要900ml 蒸馏水或去离子水稀释),充分混匀后备用。
1.3.3 样品稀释和加样
用样品稀释液将待测血清按1:100 稀释(可用试剂盒中血清稀释板进行稀释,或可直接吸取血清按比例稀释后振荡30s)。将包被板样品孔每孔先注入1μl 待测血清,再注入99μl样品稀释液。阴性和阳性对照孔不稀释,阴性对照孔每孔加入100μl 阴性对照品;阳性对照孔每孔加入100μl 阳性对照品。空白对照孔2 孔,每孔加入100μl 样品稀释液。全部加样完成后,用振荡器振荡30s。盖好封板膜,37℃避光恒温箱反应30min(详见表1)。
1.3.4 包被板洗涤
揭开封板膜,甩去孔内液体。排枪注满配置好的洗涤液(约300μl),滞留1min 后甩去。重复洗涤3 次,最后一次甩净,在吸水纸上拍干。
1.3.5 加酶反应
除空白对照孔外,其余每孔加入酶标结合物50μl,盖好封板膜,37℃避光恒温箱反应30min。
1.3.6 包被板洗涤
揭开封板膜,甩去孔内液体。排枪注满配置好的洗涤液(约300μl),滞留1min 后甩去。重复洗涤3 次,最后一次甩净,在吸水纸上拍干。
1.3.7 显色反应
按照一板96 孔用量,取底色液5ml 和显色液5ml 充分混合,每孔加入100μl,盖好封板膜,37℃避光恒温箱反应10min。
1.3.8 终止反应
取出包被板,揭开封板膜,每孔加入50μl 终止液。以空白对照孔调零,用酶标仪于450nm 读取OD 值[3]。
2 参考值设定和读数结果
2.1 有效性判定
阴性对照孔OD 值≤0.15 则实验有效,反之无效;阳性对照孔OD 值≥0.5 则试验有效,反之无效。
2.2 Cut—off 值
Cut-off 值(Cov)=阴性对照孔平均OD 值×2.1(阴性对照孔OD 值小于0.08 的,按0.08 计)。样品OD 值≥Cov 的,判断口蹄疫病毒O 型抗体阳性;样品OD 值≤Cov 的,判断口蹄疫病毒O 型抗体阴性。
2.3 读数结果
本次试验共使用3 块ELISA 板,每板2 个阴性对照孔OD值均小于0.15,3 块ELISA 板试验结果均有效。计算出1 号板Cov 值为0.168,抗体阳性孔数88 个,抗体阴性孔数2 个,合格率97.7%;2 号板Cov 值0.187,抗体阳性孔数86 个,抗体阴性孔数4 个,合格率95.5%;3 号板Cov 值0.178,抗体阳性孔数34 个,抗体阴性孔数0 个,合格率100%(详见表2)。
表2 3 块ELISA 板抗体阳性情况统计
3 讨论
在兽医临床血清学检测上,正向间接凝血试验、固相阻断ELISA 和液相阻断ELSIA 都是常用的疫苗抗体效价检测方法。但液相阻断ELISA 具有敏感性良好,特异性较高,重复性优良,检测速度更快等优势,因此,在检测大批量样本时通常表现出良好的适用性,可以更准确地评估疫苗免疫效能。
本试验为某羊羊牲畜养殖家庭农场所使用代号JYBL-2014-5-21 的口蹄疫O 型灭活疫苗抗体效价检测提供了可靠的试验数据,能有效指导该场口蹄疫防治工作,为本县的O 型口蹄疫防控工作提供了坚实的保障。
此次试验结果表明,抗体效价保护率为97.2%。