有害结局路径的研究进展和现状

石磊磊，张元元，王菲菲，郭少娟，杨立新

1.中国环境科学研究院环境基准与风险评估国家重点实验室，北京 100012

2.包头医学院公共卫生学院，内蒙古 包头 014040

传统毒理学方法难以满足日益增长的化学物质毒性评估，现有的评估程序对于复合污染也可能不够完善，再加上动物实验“减少、优化、替代”的“3R”原则日渐深化，导致现阶段开发建立更为科学合理的模型或工具来预测现有研究资料较为匮乏的化合物或者复合污染物的毒性效应及风险变得尤为重要［1］。近年来，将系统生物学和毒理机制研究相结合的研究思路增加了人们对环境污染物暴露和健康风险之间联系的理解［2］。一百多年以来，毒理学家们一直很清楚将分子起始事件（molecular initiating event，MIE）（例如DNA 损伤）与有害结局（例如癌症）联系起来的机制的重要性。在2010年之前，这类机制通常被称为毒性机制、作用方式或毒性途径，但是如何在分子毒性机制与有害结局之间建立因果联系一直是难以解决的问题。有害结局路径（adverse outcome pathway，AOP）概念的出现正是在毒性机制的基础上，通过不断探究其作用方式及毒性途径，将MIE 与有害结局联系起来形成概念性框架［3］。在世界卫生组织/国际化学品安全规划署讨论作用模式的同时［4］，2010年美国环境保护署研究小组的Gerald T.Ankley 首次提出了AOP 的概念［5］。之后，2012年经济合作与发展组织（Organization for Economic Cooperation and Development，OECD）正式启动并开始实施AOP 开发计划，2013年OECD 发布了AOP 指南［6］。2014年，OECD 与欧洲委员会联合研究中心、美国环境保护署和美国陆军工程师研发中心共同推出AOP知识数据库（adverse outcome pathway-knowledge base，AOP-KB；https://aopkb.oecd.org/）［7］。自2010年建立以来，AOP框架旨在提高化学品安全评估的效率和透明度［8］。近年来，AOP 的发展涵盖了一系列新的端点和化学品，包括纳米粒子和其他类型的压力源，如微塑料和辐射［9-10］。

作为毒性测试替代方法开发及未来环境健康风险评价的重要理论框架，AOP 是一个以毒性通路为基础，使用计算生物学新方法和基于人体生物学的体外测试组合为手段，围绕对具有法律法规及管理决策意义的毒性作用终点，开展对一系列关键事件（key events，KEs）进行评价的一种新型毒性测试策略和风险评估体系。AOP 有定性和定量两种类型。尽管AOP 通常是用定性语言描述的，但可以通过数学模型来量化，通常采用经验剂量-反应模型、系统生物学模型、贝叶斯网络来定量［6］。本文将从AOP 概念、结构、应用及展望等方面进行综述，以期为新型化学品和复合污染物的毒性测试及风险评价提供新的思路和方案。

1 AOP基础概念

1.1 AOP的定义及发展

AOP是将MIE与有害结局联系起来的机制，通常是通过KEs，以关键事件关系（key event relationships，KERs）将MIE与有害结局联系起来的一系列连续事件［1］（见图1）。AOP 整合了各种KEs，将分子或细胞水平上的生物扰动与毒性事件联系起来，分析在生物和人群水平上的有害结局。AOP 最核心的内容在于将分子、细胞、组织、器官、个体及群体水平的一系列毒性事件模块化，并在这些毒性事件之间建立逻辑推理链条。在AOP 概念提出之前，毒理学研究的关注点是相对孤立的。OECD 近几年先后发布了《AOP 开发计划》《AOP 研发和评估指导文件》《AOP 用户手册》，以及《对AOP 开发指导文件的增补》等一系列指导文件，并对国际统一的AOP 知识库进行推广，推进了AOP 的开发、评估和使用，促进了AOP 概念的不断发展和成熟，促使了毒性试验管理和风险评估模式发生转变［12］。

图1 有害结局路径示意图［11］Figure 1 Schematic representation of adverse outcome pathways［11］

1.2 AOP的结构

随着生态毒理学、计算机毒理学、生物信息学及系统生物学等学科的发展，AOP 以毒性通路及作用模式为理论基础，逐渐发展成为一项独立的指导框架。一个完整的AOP 是通过KEs 将MIE 与有害结局联系起来（见图2），一个AOP 中只能包含唯一的MIE 和有害结局，MIE 是所有步骤的先决条件［13］。有时一个MIE 会造成多种不同的有害结局。还有可能多个MIE会最终导致同一个有害结局。因此，化学物质及复合污染物的毒性机制及健康风险评价可能会由多条AOP 构成。

图2 有害结局路径结构Figure 2 Structure of adverse outcome pathways

KEs 是可测量的、可观察到的和可重复的生物或生化事件［14］。因为KEs 可以影响有害结局［12］，故在AOP 框架中是必要且至关重要的存在。KEs 本质上是对生物变化的检测或观察。AOP 则是从化学物质与生物系统的分子相互作用开始，最后再到影响种群生存能力的有机体反应，通过在不同生物水平上识别可测量的KEs 来描述的，因此提高KEs 的准确性和精确性十分重要［15］。

2 AOP-KB

AOP-KB（https://aopkb.oecd.org/）是OECD用于AOP开发的一个工具，可通过识别共享AOP来自动生成AOP网络，因此越来越多的AOP被描述和储存于AOPKB中。AOP-KB 包含四个独立的模块，即AOP Xplorer、Effectopedia、中间作用数据库（intermediate effects database，IEDB）和AOP-Wiki［16］，来连接基础数据中心的服务器，见图3。

图3 有害结局路径知识库Figure 3 Knowledge base of adverse outcome pathways

2.1 主要模块功能

AOP-KB 用于支持和向科学界共享信息，并协调生成新AOP 模式［17］。其中，AOP-Wiki（https://aopwiki.org/）于2014年9月发布，目前是维护最活跃、填充最密集的AOP-KB 模块，它提供了一个开源接口，作为AOP 的中央存储库，便于AOP 知识的共享和协作性AOP 开发。截至2020年7月，共有349 个AOP，但其中有一百多个仍然被OECD 认为是处于“发展中”，在正式批准之前可能会发生变化。随着AOP-KB 的成熟，AOP 开发将越来越关注于填补AOP-Wiki 中的数据和知识空白，已识别的AOP存储在AOP-Wiki 在线数据库中，它可以根据KEs 的证据来洞察机制信息［18］。

另外，AOP-Wiki 还可以与其他数据库资源关联。例如与AOP-DB（https://aopdb.epa.gov/）的关联，它可以将存储在AOP-Wiki 中的信息与疾病、化学基因关联，分类信息和其他生物实体相关联，这些关联与AOP-Wiki 中的AOP 信息集成在一起，从而可以在生物信息的多个区域下自动表征AOP，并为每个AOP 提供更广泛的相关生物学背景，扩展研究人员对化学应激源和毒理学结果的预测［19］。

Effectopedia（https://effectopedia.org/）是2016年发布的侧重于分子结构关系的模型平台，应用于AOP的结构化和计算机化的详细开发［20］。它提供了一种图形模式，可以直接整合AOP 网络和架构用于研究和帮助形成法规决策，以及进行AOP 信息的共享和评议。Effectopedia 目前仅作为一个独立的应用程序使用，但预计未来将作为一个在线工具，收集所有支持KERs 的定量数据［14］。Effectopedia 平台的目标之一是通过整合和比较各种建模方法的结果来促进定量AOP的创建。

AOP Xplorer 是2016年发布的能够利用可视化网络生成 AOP 关联图形的软件工具，研究者可以根据已知 KEs 及其相互关系，整合AOP 推论性信息，利用生物信息学工具进行AOP研究。当AOP-Wiki 捕获通过专家审查后的AOP 时，AOP Xplorer 将自动收集AOP 网络，并采用图形网络展示，方便专家后续探索研究［21］。

IEDB是法规框架内与化学相关的AOP 组分，该模块通过国际统一化学资讯数据库软件构建AOP-KB 和OECD 化学品筛选信息数据集的联系，并将AOP 与特定的化学信息相连接，以促使AOP 在法规中的应用。目前该模块仍在开发中，该软件的第6 个发行版将提供此模块。

2.2 根据MIE对AOP进行分类

截至2020年7月在AOP-Wiki 中，共有349 个AOP被纳入AOP-KB 中。根据MIE 对AOP 进行分类总结，其中完整AOP 中有46 种MIE，具有MIE 的AOP 有84 个。按照AOP 数量排序，排名前5 的MIE 分别为乙酰胆碱酯酶、芳烃受体、雌激素受体、环氧合酶以及钠通道（见表1）。

表1 根据分子起始事件对现有有害结局路径分类Table 1 Classification of adverse outcome pathways based on molecular initiating events

3 AOP应用及展望

目前，AOP 框架被广泛运用于不同领域化学物质风险评估，例如复合污染物毒性评估、食品安全及环境风险等［22-23］。鉴于AOP的结构特性，化学物质及复合污染的毒性机制及环境风险评价可能会由多条AOP构成，需要使用结合单个AOP的AOP网络［24］。虽然目前AOP仍然处于发展初级阶段，但AOP 为解析多种化学物联合毒性效应机制及风险提供了逻辑框架和理论基础。AOP可以作为整合测试与评估方法（integrated approach to testing and assessment，IATA）的基础来进行环境风险评估［25］。IATA是目前OECD正在开发的一种实用的、基于科学的化学品危险特征描述方法，它依赖于对现有信息的综合分析，并通过使用测试策略生成新信息。IATA能够整合包括定量构效关系、化学、体内、体外、毒物基因组学及转录组学等方法的毒性研究结果，再结合包括暴露信息在内的其他类型信息，对化学品及化学品复合污染风险评价提供指导策略［26-27］。

随着越来越多的AOP 被开发和描述，共享一个或多个KEs 的互连AOP 的系统或组合，使AOP 网络逐渐形成［28］。AOP 网络可以将许多不同的MIE 连接到不同的有害结局，描述向有害结局进展所需的KEs 的特定组合或途径，并可用于更现实地描述混合毒性反应和环境风险评价。AOP 对于化学物的风险评估主要包括定性分析和定量分析两种类型。目前在AOP数据库中大多数AOP 通常是用定性分析，只有少量的AOP 完成了定量分析。AOP 的定量分析通常通过数学模型来量化，还需要收集大量的毒性数据，因此开发适用于毒理学领域的创新计算方法对研究者具有重要意义［29］。下文分别选择以二噁英及类二噁英激活芳烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AhR）介导的定性AOP 和溴酸钾（KBrO3）诱导慢性肾脏疾病的定量AOP，对AOP的应用情况进行分析。

3.1 AOP的定性分析

大多数的AOP 都是用定性语言描述的，在环境风险监测和管理、食品安全、水体复合污染物的毒性评估等许多方面已经开展了AOP 定性分析研究。例如，二噁英及类二噁英首先激活AhR，导致AhR/芳烃受体核转位因子的二聚及I 相和II 相代谢酶的诱导，然后引起细胞、器官、个体水平上的一系列效应，最终对整个种群产生影响。AhR-AOP 框架可把二噁英及类二噁英通过AhR 介导的分子效应和在细胞、器官、个体或者群体水平上观察到的有害结局联系起来，进行一系列生物毒性的研究及风险评估，可以指导探索新型物质及物种敏感性方面的新观点和发现，同时也可展望二噁英及类二噁英在生态毒理学及风险评估领域的未来研究方向，如图4。目前该AOP 正在录入到AOP-Wiki 网络中。

图4 芳烃受体介导的有害结局路径示意图［30］Figure 4 Adverse outcome pathways mediated by activated aryl hydrocarbon receptor［30］

3.2 AOP 的定量分析

定量风险评价是化学品和环境风险评估的核心需求，因此需要明确KEs 之间的定量关系。量化KERs是一项复杂的任务，特别是所讨论的KEs 在不同的生物水平，例如一个在转录水平而另一个在酶活性或细胞器功能水平［31］。为了更好地定义两个KEs 的定量关系，可能需要更详细的实验证据。为了充分阐明分子间的相互作用，需要利用简单的方程式或者更复杂的数学模型来建立AOP。2019年一项基于KBrO3人肾近端小管上皮细胞体外毒性数据的氧化应激诱导慢性肾脏疾病的AOP（见图5）研究比较了经验剂量-反应模型、贝叶斯网络校准和系统生物学模型（三种建立定量AOP的方法）［6］。该研究使用Effectopedia 将实验数据和开发的模型统一存储，以便比较和进一步分析。该研究对以上三种AOP 量化方法进行分析并比较了这三种方法的优缺点，研究认为基于剂量-反应关系的定量AOP 最容易开发，但是其推论和解释能力有限；贝叶斯网络比剂量-反应模型更精确，比系统生物学模型更简单，但是需要更多的使用经验，实验设计要有一定限制，并且统计处理较为复杂；系统生物学模型的开发较为复杂，但是分析出的信息更详细［6］（见图6）。

图5 慢性肾脏疾病的有害结局路径［6］Figure 5 Adverse outcome pathways of chronic kidney disease［6］

图6 氧化应激诱导慢性肾脏疾病的有害结局路径量化方法比较Figure 6 Comparative analysis of quantitative adverse outcome pathways induced by oxidative stress in chronic kidney disease

3.3 AOP应用前景

对研究人员和监管机构来说，AOP 是一种从数据中生成知识和降低化学和生物学复杂性的新方法。随着AOP 及其计算工具的进一步发展和利用，它可能已成为监管机构用于建立监督定义及新方法学的最简单的一种方法［32］。例如，研究者开发了一种人工智能文本挖掘和发表摘要的评分方法来识别物质与AOP事件的联系，称之为AOP-helpfinder，利用这种方法不仅能够将双酚F 链接到一个单独的AOP，而且还能够将这些异构体关联到一个复杂的AOP 网络，来加速物质与有害结局的连接，并识别潜在关键步骤，这对于表示一种混合物的有害结果以及一种物质的多种结果是特别关键的［33］。

在风险评估和法律法规决策制定中，AOP 的实际应用是至关重要的。AOP 作为一种毒性测试替代方法，用于构建环境健康风险评价的重要理论框架，它以毒性通路为基础，使用计算生物学新方法和基于人体生物学的体外测试组合为手段，围绕对具有法律法规及管理决策意义的毒性作用终点，对一系列KEs 开展毒性测试和风险评估。例如，为配合《化妆品监督管理条例》的发布实施，王雪梅等［34］研究了应用基于AOP 原理研发的IATA 来评价皮肤的致敏性及致敏效力，对比研究了OECD 在IATA 指导文件中列举的 12 种致敏整合测试与评估策略的方案，与小鼠局部淋巴结试验或人类数据的准确率及优缺点。AOP 中KEs 越多，数据信息越全面，其预测准确率越高，但同时成本也越高。整合策略的局限性仍受各单个方法检验能力及局限性的影响。

尽管在利用AOP 进行化学物质风险评估的过程中，将MIE 与有害结局联系起来进行全面深入的分析，能够为化学物的毒性危害鉴定及生态环境风险评价提供新思路。但因AOP 仍然处于发展的初级阶段，研究者对于一些基础概念的理解可能还会存在不确切的地方，AOP 方法学本身也还存在一些尚待解决的问题。此外，AOP 在很多方面也面临着巨大的挑战，比如如何节约评估成本，降低评估的复杂度，如何对混合化学物进行联合风险评估，与传统毒性评价比较的优势以及如何实现兼容，大量数据需要模拟预测和实验佐证不确定性如何定量等问题。考虑到全世界对AOP 的需求和兴趣［35-36］，未来AOP 领域将会有长足的进步和发展。技术管理指南方法是否需要引入关于AOP 开发和评估的指导文件、AOP 框架及AOP 知识库等，都是我国毒理学及环境科学领域研究人员需要关注和思考的问题。