高pH急性和慢性胁迫对克氏原螯虾非特异性免疫和抗氧化能力的影响

田立立，万金娟，孟祥龙，周梓涵 ，孙龙生，唐建清

(1.扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009；2.江苏省淡水水产研究所，南京210017)

pH既是水体水质、水域环境的重要监测指标，也是影响养殖生物生存状况的重要生态因子。研究表明，甲壳类动物均有其pH耐受和适宜范围，当水体pH偏离其适宜范围时，势必会导致其存活、摄食、生长代谢、离子平衡和外骨骼的矿化作用等受到一定程度的影响[1，2]。在虾蟹养殖过程中，为净化水质或为蜕壳时提供隐蔽躲藏场所种植的大量水草，由于合作用导致水中CO2大量消耗，易引起水体pH值的升高[3，4]。

克氏原螯虾(Procambarusclarkii)，又称小龙虾，不仅肉质细嫩，风味独特，营养丰富，而且又可作为工业及医学原料，已成为最受欢迎的水产品之一[5]。目前国内外关于高pH对克氏原螯虾的胁迫研究主要集中在急性胁迫方面，如陶易凡等[6]报道了急性高pH胁迫会加剧克氏原螯虾肝胰腺和鳃组织结构损伤；Ali等[7]研究认为高pH胁迫24 h内克氏原螯虾碳酸酐酶(CA)、Na+/K+- ATP酶(NKA)和V型H+- ATP酶(HAT)显著表达，而关于高pH慢性胁迫对克氏原螯虾的影响鲜有报道。本试验以养殖水体pH为变化因子，探讨高pH急性和慢性胁迫对克氏原螯虾非特异性免疫及抗氧化能力的影响，为克氏原螯虾生态健康养殖提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验用虾

试验虾取自江苏省淡水水产研究所扬中基地。选择规格基本一致、活力好、附肢健全、均体重为(21.11±0.83)g的养成虾用于试验。应激试验前将试验虾暂养在室外水泥池(2 m×2 m×0.8 m，水深30 cm)15 d，每天早晚(8：00和18：00)各投喂商品料一次，投喂量为虾体重的2%～4%。水泥池采用微流水系统，试验用水为四级过滤后的长江水。

1.2 试验方法

试验虾暂养15 d后禁食24 h，随后转入室内养殖箱(70 cm×40 cm×30 cm，水深10 cm)中进行高pH应激试验。设置对照(pH 7.6)和试验(pH 10.2)2个pH处理组，对克氏原螯虾进行急性(0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、5 d)和慢性(10、15 d)pH胁迫试验。试验组用NaOH调节水体pH，使试验水体pH始终保持在10.2左右 ，连续处理15 d，每个处理3个重复，每个重复20尾虾。试验用水为曝气2 d以上的自来水，水温23.5～24.5 ℃；试验期间正常投喂，并在投喂2 h后清除残饵及粪便，同时观察虾的活力，并及时捞出死虾。尽量减少人为干扰，防止额外应激。

1.3 样品采集与处理

参照文献[6]的方法，分别在pH应激前(0 h)和应激后3 h、6 h、12 h、24 h、5 d、10 d和15 d从每箱随机选取2尾虾(每组6尾虾)，分别采集血浆、鳃和肝胰腺组织。用 1 mL 预先加入预冷抗凝剂的无菌注射器从螯虾头胸甲背侧取血淋巴，注入到1.5 mL无菌离心管中，使血液与抗凝剂最终比例为1∶1，离心( 4 ℃，3 000 r/min) 10 min，取上清，-20 ℃保存备用。用无菌镊子取螯虾的鳃丝、肝胰腺放入1.5 mL 离心管中，液氮速冻，-20 ℃保存备用。

1.4 测定指标与方法

肝胰腺、鳃样品解冻后，加入9倍体积的生理盐水冰浴匀浆制成10%匀浆液，以10 000 r/min离心10 min，取上清液待测。

血浆指标：总蛋白(TP)、溶菌酶(LZM)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、葡萄糖(GLU)、皮质醇(CORTISOL)；肝胰腺指标：超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱苷肽过氧化物(GSH-Px)、丙二醛(MDA)；鳃指标：乳酸脱氢酶(LDH)、Na+-K+-ATP酶(NKA)。测定均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒，按照使用说明进行操作。

1.5 数据分析

用EXCEL记录数据，以平均值±标准差(Mean±SD)表示。采用SPSS 20.0对试验结果进行单因素方差分析(One-Way ANOVA) 及Duncan多重比较，显著性水平设定为P<0.05。大、小写字母不同分别表示组内不同时间点、组间相同时间点差异显著。

2 结果与分析

2.1 高pH胁迫对克氏原螯虾血浆免疫相关指标的影响

各时间点对照组血浆免疫指标无显著变化(图1)。高pH急性胁迫下，试验组TP含量随胁迫时间的延长呈上升趋势，胁迫24 h时开始显著提高，且显著高于对照组。高pH慢性胁迫下，试验组血浆TP含量进一步提高；试验组与对照组间血浆LZM活性无显著差异。高pH急性胁迫下，6 h与5 d时试验组血浆AKP显著高于对照组，并于24 h恢复至应激前水平。高pH慢性胁迫下，AKP活性显著升高，之后持续保持较高水平；高pH急性胁迫显著提高试验组ACP活性，高pH慢性胁迫下试验组血浆ACP活性先上升后下降，且于胁迫10 d时酶活性达到峰值，胁迫后各时间点ACP活性均显著高于对照组。

图1 高pH胁迫对克氏原螯虾血浆免疫指标的影响

2.2 高pH胁迫对克氏原螯虾血浆血糖和皮质醇含量的影响

由图2可知，各时间点对照组血糖与皮质醇含量无显著变化。高pH急性胁迫下初期试验组血糖变化不大，5 d时血糖含量显著升高，且显著高于对照组。高pH慢性胁迫时，血糖含量呈下降趋势，并于10 d时恢复至应激前的状态水平；高pH急性胁迫时试验组血浆皮质醇含量持续升高，于5 d时达到峰值。高pH慢性胁迫下，试验组血浆皮质醇含量下降，10 d时恢复至正常水平。

图2 高pH胁迫对克氏原螯虾血糖和皮质醇含量的影响

2.3 高pH胁迫对克氏原螯虾肝胰腺抗氧化能力的影响

各时间点对照组克氏原螯虾肝胰腺SOD、GSH-Px、MDA水平无明显变化(见图3) 。高pH急性胁迫下试验组SOD活性呈下降趋势，并于24 h开始显著低于对照组，胁迫5 d时，试验组SOD活性达到最低值。高pH慢性胁迫下，SOD活性显著上升，恢复至应激前水平；与应激前相比，高pH急性胁迫(3～24 h)显著降低试验组GSH-Px活性。高pH慢性胁迫下GSH-Px活性先升高后降低，并于10 d达到峰值，且显著高于对照组；高pH急性胁迫前期(24 h内)试验组MDA含量无显著变化，5 d时试验组MDA含量显著上升。高pH慢性胁迫下，试验组MDA含量于胁迫10 d时达到峰值，且显著高于对照组。胁迫5～15 d之间试验组MDA含量没有显著差异。

图3 高pH胁迫对克氏原螯虾肝胰腺抗氧化能力的影响

2.4 高pH胁迫对克氏原螯虾鳃组织代谢酶活性的影响

图4结果显示，各时间点对照组鳃LDH、NKA活力没有显著差异。在高pH急性胁迫初期(12 h内)，试验组LDH活力呈下降趋势，且显著低于对照组。24 h后试验组LDH活力恢复至应激前水平，与对照组相比无显著差异。高pH慢性胁迫下，LDH活力呈下降趋势，但均与对照组没有显著差异；高pH胁迫对试验组鳃NKA活力没有显著影响。随着胁迫时间的延长，试验组NKA活力呈波浪式变化，但均与对照组没有显著差异。

图4 高pH胁迫对克氏原螯虾鳃乳酸脱氢酶、Na+-K+-ATPase活力的影响

3 讨论

3.1 高pH胁迫对克氏原螯虾血浆免疫指标的影响

温度、环境氨氮水平和蜕皮周期等均会影响甲壳类血淋巴总蛋白含量，其水平变化反映了机体的营养状态[8]。Chen等[9]认为pH的改变可能会影响机体蛋白质代谢速率，从而导致血淋巴总蛋白含量降低。本试验研究结果表明，试验组血浆总蛋白含量呈上升趋势。高pH下甲壳类动物将有毒的氨氮合成为无毒的氨基酸，储蓄在血淋巴和肌肉中[10]，从而引起机体游离氨基酸和蛋白含量的增加。

溶菌酶、碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性常用于评价机体免疫力。LZM可水解革兰氏阳性细菌细胞壁的乙酰基多糖，从而抑制微生物生长，增强机体免疫力[11，12]。本试验中两种pH条件下血浆溶菌酶活力均没有显著变化，这与赵先银等[13]在中国明对虾(Fenneropenaeuschinensiss)、凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)和日本囊对虾(Penaeusjaponicus)上的研究结果不符。这说明克氏原螯虾对高pH有较强的适应能力，维持内环境稳态。ACP和AKP是肝胰腺中重要的磷酸单酯水解酶，在细胞吞噬、磷酸基团的转移、机体蛋白质的合成和钙磷代谢等过程中发挥重要作用[14，15]。本试验中，试验组血浆AKP呈“M”型变化，ACP呈上升趋势。分析原因可能是克氏原螯虾为维持自身内环境稳态而采取的一种主动防御措施，这也是一种被动的病理显示[16]。高pH胁迫使克氏原螯虾免疫机能受到一定抑制，磷酸酶活性上升有助于保护机体，减少氧化损伤。此外，本试验中血浆酸性磷酸酶高于碱性磷酸酶，且二者达到峰值的时间点不一致，这是由于酸性磷酸酶参与机体死亡细胞的自溶作用[17]，凋亡细胞内酸性磷酸酶活性偏高。

3.2 高pH胁迫对克氏原螯虾应激反应的影响

应激反应是机体受到紧张性刺激物(应激源)产生的保护性机制，应激状态下，虾通过升高皮质醇来降低合成代谢，加速分解代谢，以应对环境的变化，同时增强糖代谢途径来增强机体供能，导致血糖含量明显升高[18]。适度的应激对机体起到一定的保护作用，但过度的应激反应不利于伤口的愈合和免疫系统对抗病原，对机体的修复反而产生不利影响[19]。急性高pH引起克氏原螯虾皮质醇分泌增加，血浆皮质醇含量增加，导致机体各组织对葡萄糖的利用率降低，机体能量供应不足，为了应对环境变化，机体增强糖代谢途径来增强机体供能，肝脏糖的异生及肝糖原的分解加强[20]，血糖水平升高。随着虾渗透压调节耗能的增加，血糖消耗加剧，因此在急性胁迫初期(12 h内)血糖含量维持在一个相对平衡的水平，而皮质醇含量显著升高。在短期的生理调整后，克氏原螯虾适应高pH环境，故高pH慢性胁迫时血浆血糖、皮质醇含量降低。

3.3 高pH胁迫对克氏原螯虾肝胰腺抗氧化能力的影响

在正常生理状态下，动物体内活性氧自由基(ROS)保持着动态平衡状态，当受到应激胁迫时，过多的活性氧自由基会促使机体内脂质发生过氧化反应，生成可对机体细胞造成损伤的MDA[21]。SOD能抑制活性氧自由基的形成，催化O2-生成过氧化氢(H2O2)[22]。GSH-Px可将H2O2分解为O2和H2O，阻止机体膜脂质过氧化，减缓细胞所受氧化应激损伤[23]。在胁迫12 h内，试验组克氏原螯虾肝胰腺MDA、SOD水平与对照组相比差异不显著，这说明急性应激时克氏原螯虾对高pH具有一定的抗逆性能和适应能力，在胁迫初期机体抗氧化防御功能正常，可以有效清除活性氧自由基。由于长时间的高pH胁迫，克氏原螯虾肝胰腺组织受损，抗氧化防御机能下降，导致脂质过氧化反应加剧，故SOD活性下降，MDA含量上升。急性高pH胁迫促使肝胰腺中GSH-Px在短时间迅速下降，慢性胁迫时GSH-Px水平回升，推测可能是由于GSH-Px对pH刺激敏感，随时间的延长，逐渐适应高pH环境。由于SOD活性的短期下降，脂质过氧化，GSH-Px活性升高，但表现出一定的滞后性，这说明不同酶指标变化响应时间存在一定差异。不同时间点GSH-Px活性一直处于较高的水平，这是由于GSH-Px可单独清除过氧化物[24]。

3.4 高pH胁迫对克氏原螯虾鳃组织代谢酶活性的影响

4 结语

高pH急性胁迫对克氏原螯虾有明显的负面效应，会对血浆、肝胰腺和鳃的免疫防御机制造成损伤，导致机体氧化应激。但克氏原螯虾对高pH有一定的适应性，随着pH胁迫时间的进一步延长(高pH慢性胁迫)，机体的某些非特异免疫指标(AKP、GLU、CORTISOL、LDH)和抗氧化能力(SOD、GSH-Px、MDA)逐渐恢复。在养殖过程中，维持适宜、稳定的pH有助于减少应激，防控病害。