加州鲈致病性镰刀菌的分离鉴定及其药物敏感性分析

2021-07-15于交平冯国清梁志凌刘振兴马艳平马江耀

淡水渔业 2021年4期

于交平，罗蒙，冯国清，梁志凌，刘振兴，郝乐，马艳平，马江耀，柯浩

(1.广东省农业科学院动物卫生研究所水产病害研究室，广州 510000；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；3.农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站，广州 510000；4.广东省畜禽疫病防治研究重点实验室，广州 510000)

加州鲈学名大口黑鲈(Micropterussalmoides)，是我国重要的淡水养殖经济品种之一[1]。2019年养殖总量477 808 t，广东省产量超过270 000 t，居全国第一[2]。但是由于养殖面积不断扩大，养殖密度逐年增加,苗种、饲料质量参差不齐和滥用药物，加州鲈的各种病害问题日益凸显，其中细菌性、病毒性、寄生虫病害相关报道较多[3-6]，而真菌性疾病研究较少[7]。

镰刀菌(Fusarium)作为一种植物致病菌被人们所熟知，可引起多种植物的枯萎、腐烂等[8]，某些菌种也会诱发人类皮肤、角膜炎症和恶性肿瘤[9]。近年来，研究发现镰刀菌对水产动物的危害日趋严重。1960年Hörter[10]首次从濒死鲤鱼(Cyprinuscarpio)分离到黄色镰刀菌(F.culmorum)，病鱼体表有大量的白色覆盖物。此后，陆续有真鲷(Pagrusmajor)[11]、加州鲈[7]、鲫(Carassiusauratus)[12]等感染镰刀菌的报道。目前治疗镰刀菌病的化学药物孔雀石绿被禁用，K制剂、龙胆紫等毒性较大，因此通过筛选出有抑菌效果的药物，可为今后水产临床药物申报提供参考依据[13]。2019年7月，广州某养殖场饲养的加州鲈头部、胸鳍、尾部出现充血发炎，随后逐渐溃烂，并附有白色丝状物，最终不断死亡。本实验组从濒死加州鲈患病部位分离得到一株优势菌。对其进行了鉴定、药物敏感性检测和生理特性研究，旨在为加州鲈病害的临床诊断和防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

健康加州鲈购自广州某公司，体长(119.23±11.93)mm，体质量(20.77±5.09)g，体表无损伤，置于室外水产实验场暂养7 d，水温(28±2)℃，每天按体重1%投喂饲料。观察并确认无发病和死亡现象后移入室内水族箱(50 cm×40 cm×28 cm)，水温(25±0.5)℃，24 h不间断曝气。

1.1.2 药敏试验质控菌株

近平滑念珠菌(Candidaparapsilosis)(ATCC 22019)由美国菌种保藏中心提供。

1.2 实验方法

1.2.1 致病菌的分离纯化

取濒死鱼患病部位，75%酒精浸洗2～3 s后无菌水冲洗3～4次，接种于PDA平板上，25 ℃恒温培养。将出现的菌丝转置新的PDA平板，直到培养物纯净为止。

1.2.2 致病菌的观察

切取小块培养物，分别放在PDA、CMC、SDA平板上，观察不同培养基菌落特征。取适量菌丝，镜检，观察菌丝、孢子等形态学特征。

1.2.3 致病菌的鉴定

使用Fungal DNA Kit提取真菌DNA。采用真菌通用引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG、ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC进行PCR扩增。PCR程序：预变性94 ℃ 3 min；变性94 ℃ 30 s，退火55℃ 45s，延伸72 ℃ 1 min,35个循环；终延伸72 ℃ 5 min。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，交由北京擎科生物科技有限公司测序。测序结果在NCBI中进行BLAST比对，选取同源性较高的序列，用MEGA 7.0邻接法构建系统发育树。

1.2.4 致病菌的人工感染实验

孢子液制备参照文献[14]。

取60尾加州鲈随机平均放入4个水族箱。腹腔注射实验组每尾鱼按0.2 mL注射浓度为1×107个/mL孢子液，对照组注射等量无菌生理盐水，以体表充血发炎判断为感染。创伤感染实验组将每尾鱼体表划伤，置于含1×107个/mL孢子的水中，对照组划伤置于自来水中，以体表有菌丝附着判断为感染。每天观察、记录感染和死亡情况，计算感染率和死亡率。

感染率=(感染鱼数/实验鱼总数)×100%，

死亡率=(死亡鱼数/实验鱼总数)×100%。

1.2.5 不同浓度的孢子液人工感染实验

孢子液制备同1.2.4，梯度稀释至1×102(T1组)、1×103(T2组)、1×104(T3组)、1×105(T4组)、1×106(T5组)、1×107个/mL(T6组)。

取健康的加州鲈105尾随机平均放入7个水族箱。6个浓度组按0.2 mL腹腔注射孢子液，对照组(C组)注射等量生理盐水。每天观察和记录死亡情况。利用Probit法计算半数致死量(LD50)[15]。

1.2.6 致病菌药敏试验

采用琼脂稀释法和微量液体稀释法，测定最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)[16]。质控菌株为近平滑念珠菌。

1.2.6.1 抗真菌药物液制备

酮康唑、氟康唑、5-氟胞嘧啶、两性霉素B、克霉唑、伊曲康唑、制霉菌素、益康唑和咪康唑购自某生物试剂公司，纯度均在98%以上。除氟康唑和5-氟胞嘧啶溶于无菌蒸馏水，其余药物均溶于DMSO。药物的测试浓度范围：两性霉素B、克霉唑、伊曲康唑、益康唑、咪康唑为0.0313～16 μg/mL，酮康唑、制霉菌素、氟康唑、5-氟胞嘧啶为0.125～64 μg/mL。

1.2.6.2 孢子液制备

制备方法同1.2.4，用RPMI-1640液体培养基稀释至1～5×105个/mL，置于4 ℃备用。

1.2.7 致病菌生理特性实验

按照Hussein等[17]的方法用无菌打孔器制备6 mm的菌饼，放于PDA平板中央，分别于5、10、15、20、25、30、35、40 ℃培养，每组3个重复；用1 mol/L的HCl和NaOH调PDA的pH为4.32、5.73、6.86、7.85、8.91、9.72、10.58、11.44，将菌饼分别放于上述平板中央，25 ℃培养，每组3个重复；将菌饼分别放于含NaCl浓度为0%、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10%的PDA平板中央，25 ℃培养，每组3个重复。均在4 d后用十字交叉法测量菌落直径。

2 结果

2.1 致病菌的形态观察

从加州鲈患病部位分离纯化得到一株真菌，命名MY1。在PDA上培养4～5d铺满平板，菌落正面白色，有发达的白色棉絮状气生菌丝(图1A)；在CMA上生长特征与PDA相似(图1B)；在SDA上，产黄色色素，菌落背面及培养基由黄色变为黄褐色，其他特征与PDA相似(图1C、1D)。

图1 MY1菌落形态

在显微镜下观察到菌丝体弯曲，具分枝，部分有分隔(图2A)；小分生孢子卵圆形或椭圆形，0～1个分隔，大小约为13.6～31.8 μm×2.8～3.9μm(图2A箭头指出)；大分生孢子镰刀型，两端较钝，顶端稍弯，多数为3个分隔，大小约为62.3～113.7 μm×3.5～6.2 μm(图2B)。

图2 MY1菌丝及分生孢子

2.2 致病菌rDNA-ITS序列分析

采用真菌通用引物ITS1、ITS4，以纯化MY1的DNA为模板进行PCR扩增，在500～750bp之间有明显的扩增条带(图3)。菌株MY1的ITS序列长度为548 bp，在GenBank上的登录号为：MN625846。经NCBI数据库进行BLAST比对，与Fusariumsolani的相似性高达99%以上。通过邻接法构建系统发育树，结果进一步表明，MY1与腐皮镰刀菌(F.solani)(KT876546.1)的同源关系最近(图4)。结合形态特征和系统发育分析的结果，断定MY1为腐皮镰刀菌(F.solani)。

图3 rDNA-ITS通用引物对菌株MY1进行PCR结果

图4 基于rDNA-ITS序列的菌株MY1的系统发育树

2.3 致病菌的人工感染实验

腹腔注射实验组鱼腹部和肛周充血发炎(图5A)；尾鳍发黑，有缺失现象(图5B)；体表有脱鳞现象。进一步解剖发现，肝脏、肠出血，脾脏发黑肿大(图5C)。在第3 d出现感染和死亡，第6 d感染率100%，第9 d死亡率为100%。创伤实验组感染鱼体表有菌丝附着(图5D)，第3 d出现感染，第4 d开始死亡，第7 d感染率100%，第11 d死亡率为100%。而两组对照组均一切正常。从濒死加州鲈上分离纯化得到的菌株，其形态特征和rDNA-ITS序列与MY1一致。可以判定腐皮镰刀菌为加州鲈的一种致病菌。

图5 实验组加州鲈发病症状

2.4 不同浓度孢子液人工感染实验

统计14 d实验结果发现，腹腔注射不同浓度的孢子液，死亡率明显不同(表1)。除对照组外，各浓度组均有死亡现象。死亡率随孢子液浓度升高而增加，其中T1和T2组死亡率较低，且均低于20%；剩余浓度组死亡率均超过50%，T5和T6组死亡率100%。根据Probit法计算，MY1对加州鲈的LD50为1.03×104个/mL。

表1 腹腔注射不同浓度组死亡统计结果

2.5 药敏实验结果

2.5.1 药物初筛

采用微量液体稀释法以药物最高测试浓度进行实验。MY1在含有两性霉素B(16 μg/mL)、克霉唑(16 μg/mL)、益康唑(16 μg/mL)和制霉菌素(64 μg/mL)的孔中生长被抑制；在氟康唑(64 μg/mL)、酮康唑(64 μg/mL)、咪康唑(16 μg/mL)、伊曲康唑(16 μg/mL)和5-氟胞嘧啶(64 μg/mL)的孔中正常生长。因此选两性霉素B、克霉唑、益康唑和制霉菌素进行后续药敏实验。

2.5.2 药物敏感实验结果

本实验质控菌株MIC值均在参考范围之内。

采用微量液体稀释法和琼脂稀释法测定4种药物对腐皮镰刀菌的MIC值(表2)。克霉唑、益康唑和制霉菌素两种方法结果一致，MIC分别为16 μg/mL、8 μg/mL和32 μg/mL；两性霉素B微量液体稀释法MIC为8 μg/mL，琼脂稀释法MIC为16 μg/mL。

表2 药敏结果

2.6 生理特性

2.6.1 温度对MY1菌生长的影响

如表3，菌MY1在10 ～35 ℃范围内均可生长；在5 ℃和40 ℃时，不生长；25 ～30 ℃生长最快；10 ℃时生长最慢。因此，菌MY1最适生长温度为25～30 ℃。

表3 温度对菌MY1生长的影响

2.6.2 pH值对菌MY1生长的影响

如表4，菌MY1在pH4.32～11.44时均可生长；随着pH值增加，菌丝生长速度先上升后下降，在pH7.85时生长最快。因此，菌MY1生长最适pH为7.85。

表4 pH值对菌MY1生长的影响

2.6.3 盐度对菌MY1生长的影响

如表5，MY1在0%～8%范围内可生长，但随着培养基中NaCl含量增加，生长速度显著下降(P<0.05)，当NaCl10%时，停止生长。

3 讨论

3.1 腐皮镰刀菌的致病性

镰刀菌种类繁多，至今已报道超过500种，是植物常见致病菌，也可感染人类及动物，具有致病范围广和致病力强等特点[18]。腐皮镰刀菌可引起凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)黑鳃病[19]、绿海龟(Cheloniamydas)背甲坏死病[20]、海马(Hippocampuserectus)皮肤坏死和溃烂[21]，也会感染斑马鱼(Daniorerio)[22]和黑斑条尾魟(Taeniuramelanopsila)[23]，致死率较高。尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)导致斑马鱼[24]、罗非鱼(Oreochromisniloticus)[25]、真鲷[11]等死亡。本研究中，发病加州鲈的症状，与已报道的加州鲈[7]、真鲷[11]等鱼类感染镰刀菌的症状相似，从患病部位分离纯化到一株优势菌MY1，通过形态学特征和rDNA-ITS序列同源比对及聚类分析，确定为腐皮镰刀菌。人工感染实验结果表明，该菌对加州鲈有较强的致病力。镰刀菌孢子浓度的增加，死亡率随之增加，说明当孢子达到一定数量时，镰刀菌病便会爆发。此外，黄文芳等[13]和可小丽等[14]研究发现，镰刀菌侵染鱼体与体表损伤或不良的养殖环境有关。因此，减少水产动物的机械损伤，净化养殖水体，或采用防治药物，降低水中的孢子浓度，抑制镰刀菌的生长，能减少镰刀菌病的发生。

3.2 腐皮镰刀菌耐药性

本研究选取了几种常见的抗真菌药物对腐皮镰刀菌进行体外药效试验，结果显示，该菌对两性霉素B、克霉唑、益康唑、制霉菌素4种药物敏感。与林嘉铭等[19]、庞溦等[20]研究结果不完全一致，究其原因可能与菌株不同环境、不同生理特性等因素有关。另外，除两性霉素B琼脂稀释法MIC值比微量液体稀释法高，其余药物两种方法结果一致，可能是由于两性霉素B对温度敏感，导致药效部分失效。张世奇[16]筛选抗水霉药物也发现琼脂稀释法MIC值较高。

3.3 腐皮镰刀菌生理特性

通过生理特性研究发现，本实验分离到的腐皮镰刀菌，对温度、pH有较广的耐受范围，且最适生长温度与加州鲈最适温度一致，表明在鱼任何生长时段，都有感染该菌的可能性。黄文芳等[7]、张艳珍等[12]研究也发现镰刀菌病原菌的适应性较强，能够很好地适应水环境。氯化钠在生产上用于鱼类真菌病的防治，本研究发现随着培养基中氯化钠含量的增加，腐皮镰刀菌菌丝生长速度显著下降，甚至生长被完全抑制。