稳定表达草鱼LamR鱼类细胞的建立及对基因Ⅱ型GCRV增殖的影响

黄志深，王 庆，吴斯宇，周文礼，王英英，尹纪元，李莹莹

(1.天津农学院水产学院，天津 300384；2.中国水产科学研究院珠江水产研究所/农业农村部渔药创制重点实验室/广东省水产动物免疫技术重点实验室，广州 510380)

草鱼(Ctenopharyngodonidella)是我国重要的淡水鱼养殖品种，2019年全国草鱼产量为553.31万吨，占全国淡水鱼总产量的21.72%。2020年中国水生动物卫生状况报告显示，草鱼因病害问题造成的经济损失约为25.8亿元，其中草鱼出血病是引起草鱼发病并造成巨大损失的主要原因之一，严重制约了草鱼养殖业的健康、持续发展[1,2]。草鱼呼肠孤病毒(GCRV)隶属水生呼肠孤病毒属(Aquareoviridae)，是中国分离的第一种鱼类病毒，目前己经报道了30多个分离株。该病毒主要引起草鱼在鱼种阶段发生出血病，死亡率可高达80%以上[3-5]。已知的GCRV可分为I、Ⅱ、Ⅲ三个基因型，其中Ⅱ型GCRV是目前主要流行型[5-8]。GCRV-Ⅱ型强毒株对草鱼致病性强，但对细胞敏感性弱，在目前已有细胞系上均不能产生明显的细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)，对Ⅱ型GCRV致病机理研究造成很大的阻碍。因此，目前对Ⅱ型GCRV的致病机理研究仍然处于初级阶段。

67 kDa LamR是细胞表面蛋白，与层粘连蛋白结合使细胞粘附在基底膜[9]。目前推测67 kDa LamR 由2个37 kDa的层粘连蛋白受体前体所构成，其细胞膜外由苏氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-色氨酸-丝氨酸重复(TEDWS repeats)，层粘连蛋白结合螺旋结构域和G肽(peptide G)构成[10]。作为表面受体，67 kDa LamR是很多细菌和病毒的识别位点。最新的研究发现草鱼37 kDa/67 kDa LamR能与草鱼呼肠孤病毒VP5蛋白相互作用并促进I型GCRV(GCRV-JX01)的感染[11]。但是否能与Ⅱ型GCRV相互作用对病毒增殖造成影响仍未见报导。本实验以Ⅱ型GCRV非敏感性细胞EPC、敏感性细胞CIK为材料，构建表达草鱼37 kDa/67 kDa LamR的稳定细胞系，研究草鱼37 kDa/67 kDa LamR对Ⅱ型GCRV增殖的影响，为Ⅱ型GCRV的致病机制研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

细胞培养基M199、胰酶、胎牛血清(FBS)为Gibco公司产品；Trizol Reagent、转染试剂Lipofectamine 2000购于Invitrogen公司；TaKaRa PrimeScript RT反转录试剂盒、DNA Marker、Taq DNA聚合酶、dNTPs、限制内切酶BamHⅠ、限制内切酶EcoRⅠ、T4连接酶、pMD19-T购自 TaKaRa公司；G418购自SIGMA公司；pEYFP-Mem质粒购自淼灵生物；Ⅱ型GCRV -HuNan1307毒株由本实验室分离保存；GFP抗体及二抗均购自Bioss公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 pEYFP-Mem-LamR重组质粒的构建

通过检索NCBI数据库获得CiLamR基因(KC825346)的cDNA序列，并根据pEYFP-Mem的多克隆位点设计引物LamR-EcoRⅠ-F：5′-TGGAATTCCATGTCCGGAGGTCTGGAT-3′和LamR-BamHⅠ-R：5′-GGTGGATCCGAGACCAGTCGGCAGCGGT-3′(下划线为酶切位点)。取健康草鱼的肝组织，按照Trizol Reagent试剂盒使用说明书进行总RNA的提取，采用TaKaRa PrimeScript RT试剂盒进行反转录，以cDNA为模板进行PCR扩增。将上述PCR产物回收纯化，与pMD19-T连接及转化，涂布于含氨苄霉素(50 μg/mL)的LB板上筛选鉴定。阳性克隆经PCR和酶切鉴定后，送至广州艾基生物公司测序，序列正确的质粒命名为pMD19-T-LamR。将上述质粒以EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ双酶切，与载体pEYFP-Mem连接及转化。阳性克隆经PCR、酶切和测序鉴定后,命名为pEYFP-Mem-CiLamR。

1.3 两种鱼类细胞的G418敏感性试验

取生长良好的EPC和CIK，用含0.25% EDTA的胰酶消化细胞后，加入含10% FBS的M199培养基将消化的细胞稀释至浓度约为1.0×106个/mL细胞悬液。吹打均匀后分装到3块12孔培养板中，每孔加入细胞悬液1 mL，放置于含5% CO2的28 ℃细胞培养箱中培养。待孔内细胞长至80%～90%后，弃掉旧培养基，用灭菌的PBS润洗2次，G418按照0、100、200、300、400、500、600、700、800、900 μg/mL终浓度加入培养板中，每天观察细胞状态，三天更换一次筛选培养基，根据细胞状态确定G418最佳工作浓度。

1.4 稳定表达CiLamR的EPC、CIK构建

胰酶消化EPC、CIK细胞，将细胞稀释至浓度约为1.0×106个/mL细胞悬液，吹打均匀后接种到6孔培养板中，每孔2 mL，放置于含5% CO2的28 ℃细胞培养箱中培养。待孔内细胞长至70%～90%后进行转染。实验分为2组，实验组转染重组质粒pEYFP-Mem-CiLamR，对照组转染质粒pEYFP-Mem。转染方法按LipofectamineTM2000说明书进行。培养8 h后更换成含10%血清的M199培养基，于28 ℃、5% CO2培养箱内继续培养48 h后于倒置荧光显微镜下观察荧光。转染后细胞按1∶4密度传代培养，待细胞贴壁率达50%～70%时加入G418筛选培养基。筛选10～14 d后，观察到阳性克隆即停药培养，多次筛选直到达到80%阳性细胞为止。

1.5 Western blot检测

胰酶消化稳定达CiLamR蛋白、转染空载体、空白对照的EPC和CIK细胞，细胞计数后分别取1×106个细胞加入200 μL含PMSF(Phenylmethylsulfonyl fluoride)的RIPA裂解缓冲液(RIPA Lysis Buffer)收样。加入50 μL 5×蛋白上样缓冲液，置于100 ℃金属浴煮沸10 min使蛋白变性，10 000 r/min离心10 min去除细胞碎片。样品经过12%浓度分离胶聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，用Mini Trans-Blot Transfer Cell(Bio-Rad)转移到0.45 μm的硝酸纤维素膜上，5%脱脂乳37 ℃封闭30 min后，4 ℃孵育商品化抗GFP 兔抗过夜(1∶500倍稀释)，二抗HRP标记的羊抗兔抗体室温孵育50 min后显色。

1.6 病毒接种

胰酶消化CIK-CiLamR-EYFP、CIK-EYFP、EPC-CiLamR-EYFP细胞和EPC-EYFP细胞，加入含10% FBS的M199培养基将消化的细胞稀释至浓度约为1.0×106个/mL细胞悬液。吹打均匀后接种到96孔培养板中，放置于含5% CO2的28 ℃细胞培养箱中培养。待孔内细胞贴壁长至80%～90%后，弃掉旧培养基，用灭菌的PBS润洗2次，设置5×106、5×105、5×104、5×103拷贝/μL 4个病毒浓度梯度，每孔加入50 μL病毒液并设3个重复和未接毒的对照组，28 ℃孵育1 h，弃病毒液，用灭菌的PBS润洗2次，加入含5% FBS的M199培养基维持液100 μL/孔，6 d后取样。

1.7 病毒含量测定

细胞病毒液反复冻融2次，三个重复合并为一个梯度样品，每个梯度样品取200 μL病毒液用OEMGA的Total RNA Kit I试剂盒提取总RNA，再使用TaKaRa的Prime Script RT Reagent Kit试剂盒进行反转录，具体步骤均参照试剂盒的说明书进行。以反转录的cDNA为模板，按照黄琦雯等[12]建立的荧光定量方法测定病毒含量。

2 结果

2.1 pEYFP-Mem-CiLamR真核表达载体构建

以EcoR I和BamH I双酶切pMD19-T-LamR质粒，通过凝胶电泳后回收得到约900 bp CiLamR ORF片段。以pEYFP-Mem-CiLamR为模板，PCR扩增获得约900 bp条带(图1)，测序结果与NCBI数据库Blast比对结果显示序列正确。

图1 质粒pEYFP-Mem-CiLamR的PCR和双酶切鉴定

2.2 EPC、CIK细胞对G418敏感性实验

设置不同 G418浓度梯度(见表1)进行EPC、CIK细胞对G418的敏感性实验。EPC细胞加入G418后第6天，G418终浓度为600、700、800 μg/mL的实验组，大量EPC细胞死亡，900 μg/mL浓度组细胞全部死亡；第9天，200、300、400、500 μg/mL浓度大量细胞死亡，600、700、800 μg/mL浓度细胞全部死亡；第12天200、300、400 μg/mL浓度细胞全部死亡，因此选取200 μg/mL的G418浓度作为EPC细胞药物筛选浓度。CIK细胞加入G418后第6天，700、800、900 μg/mL浓度下CIK细胞全部死亡，300、400、500、600 μg/mL浓度大量细胞死亡；第9天200、300、400、500、600 μg/mL浓度全部细胞死亡，100 μg/mL大量死亡，12 d后全部浓度细胞均死亡，因此选取100 μg/mL的G418浓度作为CIK细胞药物筛选浓度(表1)。

表1 G418敏感性实验结果

2.3 稳定表达CiLamR细胞系的构建

通过多次G418加压筛选，转染pEYFP-Mem和pEYFP-Mem-CiLamR的EPC、CIK细胞系约有80%的细胞可稳定表达EYFP荧光蛋白(图2)。

图2 表达pEYFP-Mem和pEYFP-Mem-CiLamR的EPC、CIK细胞

2.4 Western blot检测CiLamR在EPC、CIK细胞中的表达

取约1×106细胞数的EPC、CIK、EPC-pEYFP-Mem、CIK-pEYFP-Mem、EPC-pEYFP-Mem-CiLamR、CIK-pEYFP-Mem-CiLamR细胞系进行Western blot检测，EPC-pEYFP-Mem、CIK-pEYFP-Mem细胞系在约30 kDa大小处识别到eYFP蛋白，EPC-pEYFP-Mem-CiLamR、CIK-pEYFP-Mem-CiLamR细胞系在约65 kDa大小处识别到eYFP-CiLamR融合蛋白(图3)。

图3 EPC、CIK细胞eYFP-LamR融合蛋白鉴定

2.5 qPCR检测GCRV-Ⅱ的病毒增殖量

分别以5×106、5×105、5×104、5×103核酸拷贝数的GCRV-HuNan1307株接种EPC、CIK、EPC-pEYFP-Mem、CIK-pEYFP-Mem、EPC-pEYFP-Mem-CiLamR、CIK-pEYFP-Mem-CiLamR细胞系，6 d后，EPC-pEYFP-Mem和EPC-pEYFP-Mem-CiLamR细胞系均未检测出Ⅱ型GCRV。CIK-pEYFP-Mem与CIK-pEYFP-Mem-CiLamR能检测到Ⅱ型GCRV增殖，但病毒拷贝数无明显差异(图4)。

图4 Ⅱ型GCRV在CIK-pEYFP-Mem和CIK-pEYFP-Mem-CiLamR细胞增殖情况

3 讨论

GCRV是引起草鱼出血病的主要原因，其中Ⅱ型GCRV是近几年流行基因型[13]。由于Ⅱ型GCRV缺乏编码FAST蛋白的基因，在感染细胞后无法产生细胞融合性CPE[14]。因此Ⅱ型GCRV的病原学研究、疫苗开发相对滞后，阻碍了病原致病机制、疫苗等防控产品的开发和应用。

多个研究均证明LamR是病原体的重要识别蛋白。Tio等[15]发现登革病毒血清型1、2和3均能与37 kDa/67 kDa LamR相互作用。37 kDa/67 kDa LamR是辛德毕斯病毒(Sindbis virus)识别并感染细胞的重要蛋白[16]。大肠杆菌K1(E.coliK1)能通过37 kDa/67 kDa LamR进入人脑微血管内皮细胞(HBMEC)。呼肠孤病毒主要通过宿主细胞吞噬泡进入细胞，并在溶酶体内释放病毒核酸和功能性蛋白，进而利用宿主细胞营养成分进行自我复制[17]。而细胞的内吞作用又有如网格蛋白介导的内吞作用，胞膜窖介导的内吞作用，巨胞饮作用[18-20]。无论哪一种内吞作用都需要膜蛋白激活对应的信号，研究发现LamR、Laminin与补体受体CR1之间的相互作用能引起细胞的内吞作用[21]。进一步的研究发现LamR通过细胞朊蛋白的内化介导网格蛋白有被小窝形成吞噬泡[22,23]。草鱼肾脏细胞是GCRV公认的敏感细胞系，李贤等[24]还发现Ⅱ型GCRV能感染草鱼鳔细胞、草鱼吻端成纤维细胞等细胞，但无法感染鲤鱼上皮细胞、锦鲤脑细胞、鲫脑细胞。使不敏感细胞表达可能的病毒受体蛋白是研究病毒感染细胞途径的手段之一[25]。本研究拟通过对Ⅱ型GCRV不敏感的EPC表达CiLamR蛋白和对GCRV敏感的CIK细胞过表达CiLamR蛋白，研究CiLamR蛋白是否在Ⅱ型GCRV感染中起重要作用。试验成功构建了表达CiLamR蛋白的EPC和CIK细胞，但是GCRV-Ⅱ不同滴度感染细胞，并未出现病毒增殖量提高的结果。本实验结果初步推测，单独的CiLamR蛋白与Ⅱ型GCRV不能相互作用引起网格蛋白介导的内吞作用，使非敏感细胞EPC感染Ⅱ型GCRV。推测CiLamR并非Ⅱ型GCRV侵染的决定性受体。根据研究，与CiLamR相互作用的是GCRV-I的VP5蛋白，但不同基因型GCRV之间VP5蛋白只有18%～23.1%的同源性[11,26]。VP5蛋白间的巨大差异可能是导致CiLamR蛋白无法识别Ⅱ型GCRV的原因。基因Ⅱ型GCRV的致病机制有待于进一步深入研究。