超高压辅助提取蓝靛果花青素工艺优化

李圣桡，李若萌，陈博朴，张 卫，周亚军

（吉林大学食品科学与工程学院，吉林长春130062）

吉林省长白山地区蓝靛果资源丰富、价格低廉，果实中含有大量的维C、氨基酸及黄酮类物质，提取物中花青素含量较高。其可被加工成蓝靛果饮料、果酱等产品销售，但因其味苦涩使其难以被接受，且加工中产生的皮渣被当作废弃物扔掉，造成资源浪费。花青素（Anthocyanidin）是一种存在于植物中的水溶性色素，具有抗氧化活性、抗病毒和防治心血管疾病等功能[1]，可以帮助食品着色，对糖尿病等多种疾病的防治都有着显著成效[2]。

长期以来，花青素的提取工艺较多采用传统溶剂浸提法，但由于其存在提取时间长、提取率低、操作复杂等问题，难以满足当今工业化需求。为寻求较为高效、快捷的提取方法，国内外学者进行了大量研究，并在超声波[3]、微波[4]、高压脉冲电场[5]等物理手段辅助提取法方面取得了一定的进展，但仍存在成本高、对提取物有破坏性等问题，因此未达到理想的提取效果。超高压辅助提取技术（Ultra-high pressure-assisted extraction，UHP）是以水或其他流体为媒介，将处理样品在100 MPa以上压力下保持一段时间，使细胞壁结构被破坏、目标产物得以充分释放的一种新型提取技术[6]。李鹏等人[7]利用超高压辅助提取桑葚花色苷并对其抗氧化活性研究。杨孝辉等人[8]利用超高压提取不同植物中的多糖。叶陈丽等人[9]利用超高压技术提取金银花中的绿原酸，但超高压辅助提取蓝靛果中花青素未见报道。采用超高压辅助提取蓝靛果中的花青素，并优化其工艺参数。以期为蓝靛果深加工开辟新途径，为花青素的高效提取提供一种新方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝靛果，吉林省延吉市二道白河镇长白工坊生态产品有限公司提供。化学试剂：盐酸、氯化钾、冰醋酸，分析纯；无水乙醇（食品级），均为北京化工厂提供。

1.2 仪器与试剂

BCD-180TMP型冷藏冷冻冰箱，海尔公司产品；PHSJ-4F型pH计，上海禹昂自动化科技公司产品；HPP600MPa/40L型超高压食品处理装置，包头科发高压科技有限责任公司产品；TU-1800型紫外分光光度计，上海元析仪器公司产品；PTF-A+200型电子天平，福州华志科学仪器有限公司产品；H2-16KR型高速冷冻离心机，湖南长沙可成仪器设备有限责任公司产品；YTLG-10A型真空冷冻干燥机，上海叶拓科技有限公司产品；HH-8型数显恒温水浴锅，苏州威尔仪器制造有限公司产品；THC-100型恒温恒湿培养箱，上海容威仪器有限公司产品；XL-02A型手提式粉碎机，杭州旭众机械设备有限公司产品。

1.3 超高压辅助提取工艺流程

1.3.1 工艺流程

1.3.2 操作要点

（1）蓝靛果粉末制备。将蓝靛果通过冻干机干燥后粉碎成粉末、1 mm过筛，密封后置于干燥环境中贮藏备用。

（2）超高压处理。取蓝靛果粉末样品于烧杯中，根据乙醇体积分数与料液比加入乙醇溶液，对其进行均质得到更均匀的样品液。改变压力和保压时间等设备参数对样品液进行处理[10]。

（3）离心。提取液放入高速冷冻离心机内，以转速4 000 r/min离心12 min。

（4）测定吸光度。取上清液，分别用pH值4.5和1.0的缓冲溶液稀释、摇匀，用蒸馏水作对照，于35℃下恒温水浴30 min，于最大波长和700 nm处分别测其吸光度。

1.4 花青素含量检测方法

花青素含量用pH值示差法检测，通过紫外分光光度法计算求值，计算公式（1）。

式中：A-(A512-A700nm)pH1.0-(A512-A700nm)pH4.5；

Mw——分子量，449 g/mol；

V——提取液总容积，mL；

n——样品稀释倍数；

ε——消光系数，26 900 L·mol-·1cm-1；

b——光程数，1 cm；

m——原料的质量，g。

1.5 试验设计

1.5.1 预试验及传统溶剂浸提工艺优化

对传统溶剂提取法及超高压提取法提取花青素进行预试验，剔除无关变量，为进一步试验做准备。通过研究乙醇体积分数、提取温度、料液比和提取时间4个因素对传统溶剂浸提法提取花青素含量的影响，并通过正交试验得出最佳工艺参数。

1.5.2 超高压辅助提取花青素单因素试验

根据预试验结果，选压力、保压时间、乙醇体积分数这3个因素进行超高压辅助提取花青素单因素试验，研究其对花青素提取量的影响。

超高压提取花青素因素与水平设计见表1。

表1 超高压提取花青素因素与水平设计

1.5.3 超高压辅助提取花青素响应面试验设计

根据单因素试验结果，选择对花青素提取量影响显著的压强（X）1、保压时间（X）2、乙醇体积分数（X）33个因素进行三因素三水平的响应面试验，优化出超高压辅助提取花青素工艺的最佳参数。

响应面优化试验变量与编码见表2。

表2 响应面优化试验变量与编码

1.5.4 对比试验

将超高压辅助提取法与传统溶剂浸提法最佳提取工艺参数与最大提取量进行对比分析，确定提取方法。

1.6 数据统计与分析

试验结果为重复测定3次的平均值，用Origin 9.1和SPSS 20.0数据统计软件对结果进行Anova和Duncan多重比较统计分析，用Design Expert 8.0.6进行响应面数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 最佳检测波长的确定

取制备的含花青素提取液，置于紫外分光光度计中进行190～900 nm全波长扫描。

蓝靛果花青素提取液光谱扫描曲线图见图1。

由图1可知，扫描光谱曲线呈平滑抛物线状，最大波峰为512 nm，故确定512 nm为花青素的最大吸收波长。

图1 蓝靛果花青素提取液光谱扫描曲线图

2.2 压强对花青素提取量的影响

在料液比1∶30，保压时间3 min，乙醇体积分数40%的条件下，研究压强对花青素提取量的影响。

压强对花青素提取量的影响见图2。

图2 压强对花青素提取量的影响

由图2可知，压强低于250 MPa时，增大压强，花青素提取量显著提高（p＜0.05）；压强达到250 MPa，增大压强，提取量显著降低（p＜0.05）。谭佳琪等人[10]提取桑葚花色苷时也观察到了相似趋势。其原因可能是一定压力值会使细胞器、细胞壁和细胞膜受损，细胞渗透能力增加，有利于提取溶剂进入细胞，促进蓝靛果中有效成分渗透到细胞外，提高花青素的提取率[11]。因此，最佳作用压强选250 MPa。

2.3 保压时间对花青素提取量的影响

在压强250 MPa，料液比1∶30，乙醇体积分数40%的条件下，研究保压时间对花青素提取量的影响。

保压时间对花青素提取量的影响见图3。

图3 保压时间对花青素提取量的影响

由图3可知，在保压时间小于3 min时，花青素提取量随保压时间的增加而显著增加（p＜0.05），当保压时间达到3 min后，增大保压时间花青素提取量显著降低（p＜0.05）。与杜月娇等人[12]在提取山葡萄花青素试验结果趋势一致。因为蓝靛果细胞随着保压时间延长而破裂，目标成分被提取出来，但时间过长会促进酶促反应进行，导致花青素降解，使提取率降低。因此，最佳保压时间选3 min。

2.4 乙醇体积分数对花青素提取量的影响

在压强250 MPa，料液比1∶30，保压时间3 min的条件下，研究乙醇体积分数对花青素提取量的影响。

乙醇体积分数对花青素提取量的影响见图4。

图4 乙醇体积分数对花青素提取量的影响

由图4可知，当乙醇体积分数为20%～40%时，花青素提取量显著增大（p＜0.05），并于乙醇体积分数为40%时达到最大，乙醇体积分数达到40%后，继续增大乙醇体积分数，花青素提取量显著降低（p＜0.05）。王鑫等人[13]利用超高压提取蓝莓花青素得到了类似的结果。原因可能是花青素属于黄酮类物质，在乙醇中的溶解性较好，随着其体积分数增大，花青素溶出率增加；当乙醇体积分数过大后，使溶液极性降低，花青素溶解性随之降低且易发生醇降现象，不利于花青素的提取。因此，乙醇最佳体积分数选为40%。

2.5 响应面设计及结果

花青素提取量Y与压强（X）1、保压时间（X）2和乙醇体积分数（X）33个因素的响应面试验设计及结果。

响应面优化试验设计及结果见表3。

2.6 回归模型建立及方差分析

对表3的数据进行回归分析，得响应变量与响应值间的二次回归方程：

表3 响应面优化试验设计及结果

二次回归模型的方差分析见表4。

由表4可知，数学模型F=36.79，p＜0.000 1，说明回归模型极为显著；失拟项F=0.755 2＞0.05，说明方程拟合良好；决定系数R2=0.979 4，调整系数R2Adj=0.952 6，说明响应值与自变量间线性关系显著，模型可信度较高。该模型可用于解释花青素提取量的变化。

表4 二次回归模型的方差分析

2.7 响应面分析

通过软件Design Expert 8.0.6分析得压强与保压时间、压强与乙醇体积分数、保压时间与乙醇体积分数的交互作用。

保压时间与压强交互作用及等高线图见图6，乙醇体积分数与压强交互作用及等高线图见图7，乙醇体积分数与保压时间交互作用及等高线图见图8。

由图6可知，响应曲面较陡，表明花青素提取量受二因素影响显著；二者轴向等高线分布均匀，呈椭圆状，交互作用较强。由图7可知，响应曲面较陡，花青素提取量受两因素影响显著；等高线呈椭圆状，二者交互作用较强。由图8可知，响应曲面较陡，花青素提取量受二因素影响较大；二者轴向等高线呈椭圆状并均匀分布，二者交互作用显著。但是，由方差分析可知，压强和保压时间、压强和乙醇体积分数、保压时间和乙醇体积分数交互作用均对花青素含量的影响并不显著。

图6 保压时间与压强交互作用及等高线图

图7 乙醇体积分数与压强交互作用及等高线图

图8 乙醇体积分数与保压时间交互作用及等高线图

2.8 响应面试验优化结果及验证

超高压提取蓝靛果花青素最佳工艺为压强260.5 MPa，保压时间3.5 min，乙醇体积分数33.1%，此时花青素提取量理论最大值为36.31 mg/g。考虑实际操作，对工艺适当调整，调整后工艺为压强250 MPa，保压时间3.5 min，乙醇体积分数33%，该参数重复3次取平均值，得花青素提取量为36.15 mg/g，与预测值接近。模型能用于预测花青素提取量。

2.9 对比试验分析

将超高压辅助提取法和传统溶剂浸提法最优工艺参数与最大提取量进行对比。

超高压提取与传统溶剂提取花青素的对比见表5。

表5 超高压提取与传统溶剂提取花青素的对比

由表5可知，相较于传统溶剂浸提法，超高压辅助提取耗时少、操作简便，且花青素提取量提高了44.3%。综合考虑实际操作、提取效果和成本，超高压电场辅助提取法能高效提取蓝靛果花青素。

3 结论

单因素试验和响应面法优化试验确定蓝靛果花青素超高压提取工艺最佳参数为压强260.5 MPa，保压时间3.5 min，乙醇体积分数33.1%，花青素最大提取量为36.31 mg/g。与传统溶剂浸提法相比，超高压辅助提取显著节省提取时间，节约了乙醇用量，花青素提取量提高了44.3%，是一种比较理想的天然产物提取方法。研究为超高压技术在生物质中有效成分的高效提取提供理论支持和借鉴参考。