补阳还五汤治疗中风的有效成分及作用机制研究*

李东红，胥芷灵，徐翠珊，贾永艳，3，张运克，2

1.河南中医药大学，河南 郑州 450046；2.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000；3.河南省中药特色炮制技术工程研究中心，河南 郑州450046

中风，又称卒中，始见于张仲景《金匮要略》，是以半身不遂、肌肤不仁、口舌歪斜、言语不利，甚则突然昏仆、不省人事为主要表现的病症，属中医四大疑难病症之首［1］，相当于现代医学的急性脑血管疾病，具有高发病率、高病死率、高致残率、高复发率的特点，严重威胁人类健康［2］。历代医家对于中风有不同见解。明清时期，王清任认为，其发病机制在于气虚血瘀，治疗需遵循养阴益气，活血化瘀和疏通经络。《医林改错·论抽风不是风》言：“元气既虚，必不能达于血管，血管无气，必停留而瘀。以一气虚血瘀之症。”并首次收载了补阳还五汤一方［3-6］。补阳还五汤由黄芪、当归、赤芍、地龙、川芎、桃仁和红花7味中药组成，具有补气通络的功效，是中药方剂中益气活血的经典方剂，在中风的临床治疗中发挥了极大的作用［7-12］。但是对于补阳还五汤治疗中风的有效成分及作用机制尚有待进一步研究。本研究基于网络药理学方法，从补阳还五汤所含成分入手，通过TCMSP中药系统药理学数据库与分析平台预测其靶点，并与中风疾病相关靶点进行对比筛选，使用Cytoscape3.6.0数据可视化软件制作中药复方成分-靶标调控网络图。通过STRING在线软件，得到中药复方-疾病靶标蛋白作用网络及中药复方-疾病靶标核心蛋白作用网络。最后使用Metascape数据库与微生信在线作图工具，制作GO富集分析与KEGG通路富集分析气泡图，以预测该方剂治疗中风的有效成分及作用机制。

1 资料与方法

1.1 补阳还五汤化学成分数据库的构建通过TCMSP中药系统药理学数据库与分析平台（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）检索补阳还五汤中7味中药所含化学成分，以OB（口服生物利用度）值≥30%、DL（类药性）值≥0.18为筛选条件获得各个中药所含化学成分，构建补阳还五汤所含化学成分数据库。

1.2 靶点预测基于补阳还五汤所含化学成分，通过TCMSP中药系统药理学数据库与分析平台对该方剂所含化学成分进行化合物-蛋白质作用靶点预测，利用Uniprot蛋白质生物功能数据库（http：//www.Uniprot.org/），获得相关基因靶点，矫正蛋白质名称。

1.3 中风疾病靶点筛选以“Acute cerebrovascular disease”为关键词在GeneCards人类基因数据库（https：//www.genecards.org/）及OMIM在线人类孟德尔遗传数据库（https：//www.omim.org/）中检索，得到中风疾病靶点。

1.4 中药复方-疾病靶标的获取通过1.2项及1.3项获得补阳还五汤相关作用靶点及中风疾病靶标后，取两者的靶点基因交集。

1.5 中药复方成分-靶标调控网络的构建将1.4项所得中药复方-疾病靶标与补阳还五汤所含活性成分对应，通过Cytoscape3.6.0数据可视化软件（http：//cytoscape.org/）处理，得到中药复方成分-靶标调控网络。

1.6 PPI网络的构建与核心靶标的筛选将1.4项中药复方-疾病靶标导入STRING在线软件（https：//string-db.org/），选择人类基因库，得到补阳还五汤作用于中风的PPI蛋白作用网络。

1.7 GO富集分析与KEGG通路富集分析将中药复方-疾病靶标导入Metascape数据库（https：//metascape.org/gp/index.html），选择物种为人类，得到基因本体论（gene ontology，GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of gene and genome，KEGG）通路富集分析信息。

2 结果

2.1 中药复方成分-疾病靶标的获取与调控网络的构建通过TCMSP中药系统药理学数据库与分析平台分别寻找补阳还五汤全部活性成分（地龙未收录，通过查阅文献［13］，得到其活性成分名称、结构式、CAS号，通过CAS号在TCMSP数据库查询），设置OB≥30%，DL≥0.18，进行初步筛选。并在该数据库内进行活性成分-蛋白靶点的预测，保留具有蛋白靶点的活性成分。利用Uniprot蛋白质生物功能数据库（http：//www.Uniprot.org/），获得相关基因靶点，除去找不到基因靶点的成分，共得到补阳还五汤活性成分63个，相关靶点242个。以“Acute cerebrovascular disease”为关键词在GeneCards人类基因数据库及OMIM在线人类孟德尔遗传数据库中搜索疾病相关靶点信息，整合二者所得数据，得到中风相关疾病靶点1 732个。利用韦恩图进行分析，取补阳还五汤中所含成分靶点及中风疾病靶点交集，获得中药复方-疾病靶标136个，药物-疾病基因映射率为56.2%，见图1。将中药复方-疾病靶标与补阳还五汤所含活性成分对应，得到补阳还五汤治疗中风的活性成分20个，见表1。通过Cytoscape3.6.0数据可视化软件（http：//cytoscape.org/）处理，得到中药复方成分-靶标调控网络，见图2，其中来自黄芪与红花的共有成分槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol），黄芪与桃仁共有成分常春藤皂苷元（hederagenin），当归、赤芍、桃仁与红花共有成分β-谷甾醇（beta-sitosterol）作用尤为明显。

图1 补阳还五汤成分靶点-中风疾病靶点韦恩图

图2 中药复方活性成分-疾病靶标调控网络图

表1 补阳还五汤作用于中风疾病靶点及对应活性成分

2.2 PPI网络的构建与核心靶标的筛选将中药复方-疾病靶标导入STRING在线软件，选择人类基因库，得到中药复方-疾病靶标蛋白作用网络，并下载结果文件。将结果文件导入Cytoscape3.6.0数据可视化软件，进行权重分析，计算degree值，将degree值＞59（二倍中位数）作为筛选依据，得到中药复方-疾病靶标核心蛋白作用网络，见图3。其中核心靶标按照degree值从大到小依次为AKT1、IL-6、ALB、TNF、VEGFA、TP53、CXCL8、PTGS2、CASP3、MAPK8、JUN、EGF、IL-1B、MAPK1、NOS3、MMP9、EGFR、CAT、CCL2、FOS、IL-10、ESR1、MMP2、IL-4。

图3 中药复方-疾病靶标蛋白作用网络及核心蛋白作用网络图

2.3 GO富集分析将中药复方-疾病靶标导入Metascape数据库，选择物种为人类，得到基因本体论（GO）富集分析信息，保存文件。以基因数作为筛选依据，GO富集分析选择前10项，作GO Biological process（BP）、GO Cellular component（CC），GO Molecular function（MF）三合一柱形图，见图4。GO富集分析提示，补阳还五汤活性成分主要富集在无机物应答、毒性物质应答、细胞因子介导的信号通路、含氮化合物的纤维素反应、氧化应激反应、纤维素酯、细菌应答、有机环化合物的细胞反应、激素刺激的细胞反应、凋亡信号通路等；在分子组成方面，主要与膜筏、膜微域、膜区、突触后、突触膜、轴突、受体复合体、液泡、突触后膜、突触前等相关；在分子功能方面，主要涉及蛋白结构域特异性结合、氧化还原酶活性、蛋白质均二聚体活性、蛋白激酶结合、激酶结合、转录因子结合、脂质结合、协因子绑定、受体调节活性、近端启动子序列特异性DNA结合RNA聚合酶Ⅱ等。

图4 BP、CC、MF三合一柱形图

2.4 KEGG通路富集分析将中药复方-疾病靶标导入Metascape，选择物种为人类，得到京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析信息，保存文件。以基因数作为筛选依据，选择富集分析信息前20项，见表2。最后用微生信在线作图工具作KEGG通路富集分析气泡图，见图5。由KEGG通路富集分析信息可知，补阳还五汤治疗中风疾病的KEGG通路主要有癌症通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路、乙型肝炎病毒、IL-17信号通路、结核病、TNF信号通路、弓形体病、蛋白聚糖在癌症的作用、恰加斯病（美洲锥虫病）、MAPK信号通路、细胞凋亡、非酒精性脂肪肝、甲型流感、细胞因子-受体相互作用、百日咳、HTLV-I感染、HIF-1信号通路及直肠癌等。

表2 KEGG通路富集分析信息表

图5 KEGG通路富集信息气泡图

3 讨论

本研究基于网络药理学理论和方法，使用数据库及相关工具寻找补阳还五汤活性成分及靶点，筛选补阳还五汤治疗中风的活性成分、靶标及核心靶标，构建中药复方活性成分-疾病靶标调控网络、中药复方疾病靶标蛋白作用网络、中药复方疾病靶标核心蛋白作用网络（protein-protein interaction，PPI）及GO、KEGG通路富集分析研究补阳还五汤治疗中风的有效成分及作用机制。结果表明补阳还五汤治疗中风有效成分20个，其中君药黄芪与红花共有成分槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol），黄芪与桃仁共有成分常春藤皂苷元（hederagenin），当归、赤芍、桃仁与红花共有成分β-谷甾醇（beta-sitosterol）作用最明显。其中槲皮素（quercetin）具有抗氧化、清除自由基、抗癌、抗炎、抗菌等生理活性［14-15］，并且具有降血糖、降血压、降血脂、抗动脉粥样硬化、抗血栓和防止冠状动脉粥样硬化性心脏病等多种心血管保护作用［16］；山奈酚（kaempferol）具有抗癌、抗氧化、降血糖、免疫调节、疾病预防、心肌保护、抗慢性脑缺血等药理作用［17-18］；常春藤皂苷元（hederagenin）具有抗肿瘤、抗抑郁、抗菌抗炎、抗糖尿病、神经保护以及改善高脂血症血液流变学等药理作用［19］；β-谷甾醇（beta-sitosterol）具有抗氧化、降低胆固醇、抗炎、抗焦虑及抗惊厥等药理作用［20］。但是，通过TCMSP数据库以OB≥30%，DL≥0.18筛选补阳还五汤中活性成分时，君药黄芪的主要成分黄芪皂苷中大多化合物未通过筛选，所以通过TCMSP数据库以OB≥30%，DL≥0.18筛选补阳还五汤中活性成分可能会存在某些主要成分的丢失。

中药复方补阳还五汤治疗中风的核心靶点主要有：AKT1、IL-6、ALB、TNF、VEGFA、TP53、CXCL8、PTGS2、CASP3、MAPK8、JUN、EGF、IL-1B、MAPK1、NOS3、MMP9、EGFR、CAT、CCL2、FOS、IL-10、ESR1、MMP2、IL-4。其中AKT1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，研究表明AKT1在血管平滑肌细胞中表达时，在动脉粥样硬化形成过程中起着关键作用，并且可以调节动脉粥样硬化进展过程中的血管重塑［21］，与肿瘤、心血管、神经系统等疾病发生相关［22-23］；IL-6、TNF、IL-1B、IL-10、IL-4均为重要的炎症因子，参与调节机体多种炎症反应［24］，其中IL-6是冠状动脉粥样硬化性心脏病的主要炎症标志物，TNF的亚型TNF-α能够增加损伤血管中炎性细胞数量，并通过协助血管平滑肌重塑参与动脉粥样硬化的病理过程；ALB、VEGFA、CXCL8会影响人体血液流变学［25-28］，血清中ALB水平的异常变化可能会引起脑梗死的复发［29］，VEGFA通过与内皮细胞膜上的受体结合，可以调节血管和淋巴管的生成；TP53可以调控细胞分裂与增殖；PTGS2基因的表达产生环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2），环氧合酶（cyclooxygenase，COX）参与花生四烯酸合成血栓素A2的过程，促进血小板聚集；MMP9和MMP2是细胞外基质重塑的关键效应物，MMP2参与神经纤维间质的浸润和分解过程，与脑组织损伤状况关系密切［30］。

中药复方补阳还五汤治疗中风的主要通路有癌症的途径、流体剪切应力与动脉粥样硬化、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路、乙型肝炎病毒、IL-17信号通路、结核病、TNF信号通路、弓形体病、蛋白聚糖在癌症的作用、恰加斯病（美洲锥虫病）、MAPK信号通路、细胞凋亡、非酒精性脂肪肝、甲型流感、细胞因子-受体相互作用、百日咳、HTLV-I感染、HIF-1信号通路、直肠癌等。研究表明高胆固醇血症诱发的动脉粥样硬化可能是通过AGE-RAGE介导的，可溶性晚期糖基化终末产物受体通过与晚期糖基化终末产物受体竞争能抑制动脉粥样硬化［31］；流体剪切应力和动脉粥样硬化通路在血脂异常向动脉粥样硬化发展过程中也发挥着重要作用；流体剪切应力是血液与内皮之间的摩擦力，是决定内皮功能和基因表达的主要因素，可以调整血管通透性［32］；激活PI3K-AktmTOR通路能保护大脑缺血再灌注损伤，具有神经保护功能，可抑制氧化应激相关的神经元自噬［33］；IL-17通路被激活后可以加速血管的动脉粥样硬化过程［34］；HIF-1信号通路可以调节血脂的代谢。由此可以看出，补阳还五汤治疗中风主要通过影响细胞凋亡与再生、改善血液流变学、影响人体代谢水平等方面多通路达到治疗效果。

综上所述，该研究通过对补阳还五汤治疗中风的网络药理学研究进一步明确了补阳还五汤治疗中风的有效成分、靶点及作用机制，这也进一步证明了中药治疗疾病的整体性原则，在发挥治疗疾病作用时，将人体作为一个整体，通过多成分-多靶点-多通路达到治疗疾病的目的。