平喘颗粒对哮喘小鼠肺组织TLR2和TLR4表达的影响*

王珏，李竹英

黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040

支气管哮喘（简称哮喘）是由多种炎症细胞及细胞组分相互作用导致的慢性气道炎症性疾病，发病过程中受到炎性介质的不断刺激而触发气道壁损伤和气道结构变化。因此，抑制气道炎症反应是防治哮喘的一个重要方向。流行病学显示，我国哮喘患病人数约4 570万，总体发病率达4.2%［1-2］。平喘颗粒是国家级名老中医刘建秋教授传承前辈思想并结合多年临床实践经验所创立，刘教授认为哮喘慢性持续期的病机根本为“阳虚痰盛”，故以“温阳益气，化痰平喘”为核心思想，组方平喘颗粒用于哮喘慢性持续期的临床治疗。前期研究发现，平喘颗粒可通过抑制上皮间质转化和血管生成、干预上皮细胞自噬与凋亡改善哮喘的病理进程［3-5］。本研究通过观察平喘颗粒对哮喘小鼠肺组织Toll样受体2（toll-like receptor2，TLR2）和TLR4表达及相关炎性因子的影响，探讨平喘颗粒对哮喘的作用。

1 材料

1.1 动物8周龄健康清洁级雌性BALB/c小鼠30只，体质量（20±2）g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号：SCXK（辽）2015-0001。

1.2 药物与试剂平喘颗粒［淫羊藿200 g，太子参150 g，黄芪150 g，五味子150 g，知母100 g，麻黄（炙）100 g，款冬花（炙）150 g，地龙100 g，罂粟壳40 g］（黑龙江中医药大学附属第一医院提供，批号：20180723）。白细胞介素-4（interleukin-4，IL-4）、IL-5、IL-13 ELISA试剂盒（杭州联科生物技术股份有限公司，批号分别为：70-EK204/2-96、70-EK205-96、70-EK213/2-96）；卵清蛋白（ovalbumin，OVA）（上海生工生物技术有限公司，批号：A003056-0100）；乌拉坦（美国Sigma公司，货号：U2500-100G）；40 ng·L-1多聚甲醛（上海碧云天生物技术有限公司，货号：P0099）；苏木精、伊红染色液（北京索莱宝生物科技有限公司，货号分别为：H8070、G1100）；PVDF膜（上海谷研生物技术有限公司，批号：GOY-C3192）；细胞裂解液（上海梵态生物技术有限公司，批号：FT-LG1227）；PMSF（北京伊塔生物技术有限公司，批号：YT1705）；BCA蛋白浓度测定试剂盒、TLR2抗体、TLR4抗体（美国Abcam公司，货号分别为：ab102536、ab209216、ab22048）；内参β-actin抗体（圣克鲁斯生物技术公司，货号：sc-47778）。

1.3 仪器Proline微量移液器［芬兰百得实验室仪器（中国）有限公司］；ELX-800型酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）；Lx81型倒置荧光显微镜（日本Olymps公司）；OLB-200B型水平摇床（济南欧莱博科学仪器有限公司）；165-8001型电泳仪（美国Bio-Rad公司）；DYCZ-40D型转移槽（北京六一仪器厂）；CM69001型-30℃恒冷低温切片机（德国Leica公司）；DWHL-668型-70℃超低温冰箱（中科美菱低温科技股份有限公司）。

2 方法

2.1 动物分组与模型复制将30只BALB/c小鼠随机分为对照组、模型组、平喘颗粒组，每组10只。模型组和平喘颗粒组采用腹腔注射加雾化OVA致敏液［100μg OVA+1 mg Al（OH）3］制备慢性哮喘小鼠模型［6］，分别于第1天、第14天腹腔注射0.2 mL致敏液，第22天后改用1%OVA溶液进行雾化，激发30 min，每周3次，连续激发8周。对照组用生理盐水代替OVA激发，平喘颗粒组从第1次雾化激发的当天开始，每天灌胃给予平喘颗粒药液，持续给药8周，激发阶段每次激发前1 h灌胃，对照组和模型组给予等体积的生理盐水灌胃，给药时间同平喘颗粒组。

2.2 血清中IL-4、IL-5、IL-13水平的检测于末次激发24 h后，采用20%乌拉坦（5 mg·kg-1）腹腔注射麻醉，摘眼球取血并制备血清，检测血清中IL-4、IL-5、IL-13水平。

2.3 HE染色观察肺的病理变化每组随机选5只小鼠，开胸取小鼠右肺的前叶及中叶部分，分离肺组织，用40 ng·L-1多聚甲醛固定保存。将固定后的组织石蜡包埋后切片，脱蜡，水洗后进行苏木精-伊红染色，观察各组小鼠肺组织的病理学改变。

2.4 Western blot法检测肺组织TLR2、TLR4的表达每组随机取5只小鼠的肺组织，提取肺组织总蛋白，进行蛋白质定量，电泳、转膜、封闭及抗体孵育、曝光。用凝胶图像处理系统分析目标条带的灰度值。

2.5 统计学方法用SPSS 22.0软件进行数据分析，计量数据采用平均值±标准差（±s）表示，组间比较用单因素方差分析（One-Way ANOVA），两两比较用LSD检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 小鼠肺组织的病理变化对照组小鼠肺组织及支气管结构正常，肺泡轮廓清晰；模型组小鼠肺组织及支气管外周可见大量的炎性细胞浸润，肺泡结构异常；平喘颗粒组小鼠肺组织上述病理改变减轻，但与对照组仍有差距，肺组织及支气管外周可见多个中等大小的炎性细胞浸润灶，肺泡结构不完整。见图1。

图1 各组小鼠肺组织病理学损伤（HE，×200）

3.2 小鼠血清中IL-4、IL-5和IL-13水平的检测与对照组比较，模型组小鼠血清中IL-4、IL-5和IL-13水平明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，平喘颗粒组小鼠血清中IL-4、IL-5和IL-13水平明显降低（P＜0.05）。见图2。

图2 小鼠血清中IL-4、IL-5和IL-13水平

3.3 小鼠肺组织TLR2和TLR4蛋白表达与对照组比较，模型组小鼠肺组织TLR2和TLR4蛋白表达明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，平喘颗粒组小鼠肺组织TLR2和TLR4蛋白表达明显降低（P＜0.05）。见图3、图4。

图3 各组小鼠肺组织TLR2和TLR4蛋白表达

图4 各组小鼠肺组织TLR2和TLR4蛋白表达

4 讨论

平喘颗粒是黑龙江中医药大学自制的中药制剂，全方共由9味中药组成。方中麻黄温通宣肺平喘，淫羊藿入肾经振奋阳气，二者为君，阳气通达，肺脏宣散之气得以肃降，肾脏气化功能得以恢复。五味子入肺肾二经，敛肺止咳，太子参补脾肺气阴，兼化痰止咳，黄芪补脾升阳。款冬花宣肺止咳，地龙泻热平喘，以上5味中药共为臣药。罂粟壳酸涩收敛，可敛肺气以止咳，同时防止君药辛散耗气，为佐药。知母甘寒养阴，润肺止咳，可降肺之气逆，引诸药归经，为使药。方中药物配伍升降有序、阴阳同补、收散并用，补益气血、温化痰湿、宣畅气机，共奏温阳益气、化痰平喘之功。研究表明，麻黄、五味子、款冬花、地龙均具有抗炎、平喘、镇咳等作用［7-11］。金华良等［12］研究发现，淫羊藿可降低哮喘大鼠肺泡灌洗液中IL-4、IL-5和IL-13水平，从而抑制气道炎症。

哮喘的发病机制复杂多变，常伴随着多种免疫细胞、细胞因子及炎性介质的参与，故免疫调节失衡是哮喘的主要致病因素之一。目前普遍认为哮喘的免疫调节失衡主要为Th1/Th2亚群比例失衡，表现为Th2细胞数目增多和功能亢进。Th2细胞通过产生IL-4、IL-5和IL-13等细胞因子，诱导初始效应细胞如嗜酸性粒细胞和肥大细胞的活化，产生大量的炎症介质，导致气道慢性炎症的发生［13-14］。病理学观察显示，平喘颗粒可减轻哮喘小鼠的肺部炎性病变。研究表明，哮喘患者血清中IL-4、IL-13水平与IgE的含量及病情严重程度呈正相关性［15-17］。IL-5可增加嗜酸性粒细胞的敏感性，刺激其增殖分化，促进组胺的释放，导致哮喘的加重［18-19］。本研究发现，平喘颗粒可降低哮喘小鼠血清中IL-4、IL-5和IL-13水平，改善哮喘的炎症反应。

Toll样受体是介导天然免疫和获得性免疫的细胞膜受体，其中以TLR2、TLR4表达范围最为广泛，可识别微生物病原体，促进多种炎性细胞及因子的释放，与哮喘的发生密切相关［20-22］。TLR2表达于多种免疫细胞和气道上皮细胞中，可通过介导下游的NF-κB通路和NLRP3炎症小体参与过敏性气道炎症［23-24］。研究发现，TLR2激动剂可增加哮喘小鼠Th2类相关因子，如IL-5、IL-13的水平，进而加重哮喘的Th2免疫反应［25-26］。TLR4在哮喘患者体内呈高表达状态，可诱导气道上皮细胞、肺泡巨噬细胞等释放细胞因子及炎性介质，激发T淋巴细胞向Th2方向分化，诱导炎症的发生［27-28］。研究显示，TLR4基因敲除可减轻哮喘模型小鼠的气道炎症和气道重塑，其机制可能与调节Th1/Th2及RORγt/Foxp3细胞因子的平衡有关［29-30］。本研究发现，平喘颗粒可降低小鼠肺组织TLR2和TLR4蛋白表达，抑制Th2细胞活化，调节Th1/Th2免疫失衡。

综上所述，平喘颗粒可缓解哮喘气道炎症，其机制可能与调控TLR2、TLR4表达，从而抑制Th2细胞活化有关。哮喘是一种多种病理因素的复杂疾病，本文虽然探讨了平喘颗粒在改善气道炎症方面的相关机制，但在哮喘作用机制方面仍有许多值得研究的领域，如气道重塑、气道高反应性、氧化应激等，平喘颗粒是否与这些作用机制有关，还需要进行深入探索。