一株野生古巴栓孔菌生物学特性的研究

史维丽，班立桐，黄亮，杨红澎，孙宁，王玉，李奕葶，张怡

一株野生古巴栓孔菌生物学特性的研究

史维丽，班立桐通信作者，黄亮，杨红澎，孙宁，王玉，李奕葶，张怡

（天津农学院 农学与资源环境学院，天津 300392）

采用单因素和正交试验法，研究野生古巴栓孔菌（）菌丝的最佳培养条件。单因素试验结果表明，古巴栓孔菌菌丝的最适碳源、氮源分别为葡萄糖、酵母浸粉，碳源、氮源的最适添加量分别为5 g/L，3 g/L，最适培养温度为35 ℃，培养基初始pH对古巴栓孔菌菌丝的生长影响不显著。正交试验结果表明，影响古巴栓孔菌菌丝体生长的因素从大到小依次为：碳源＞温度＞氮源。最佳培养基配方为：葡萄糖15 g/L，酵母浸粉3 g/L，硫酸镁0.5 g/L，磷酸二氢钾 1 g/L，VB10.01 g/L，琼脂18 g/L，pH自然，36 ℃培养。

古巴栓孔菌；菌丝生长；温度；碳氮源；正交试验

随着我国经济的快速发展，人们对美好生活的需求日益广泛，对绿色生态食品越来越重视，作为绿色生态食品之一的药食用真菌也引起人们的高度关注。野生药食用菌是我国重要的生物资源，也是科学研究的重要类群[1]。现代医学研究表明，药用真菌不仅有强身健体、延绵益寿的功效，还具有抗肿瘤、抗癌的作用。在《神农本草经》中就记载了6种灵芝、茯苓、桑耳等12种真菌的形态和功效[2]。据统计，全球共有真菌150万种以上，目前人们知道的真菌仅有7万种左右，食药用真菌逾2 000种，现在被驯化并用于商业栽植的有100多种。因此，野生食用菌资源的利用价值非常高[3-5]。

编码rDNA序列分析是对未知生物的鉴定或者表型结果验证常用的方法[6-8]。笔者在前期采用编码rDNA序列分析对供试菌株TNCY002进行了鉴定，鉴定出该野生真菌为真菌门（Eumycota），担子菌亚门（Basidiomycotina），层菌纲（Hymeno- mycetes）非褶菌目（Aphyllophorales），多孔菌科（Polyporaceae），栓菌属（），古巴栓孔菌（）。鉴定结果在GenBank上的登录号是MN068933.1。

野生大型真菌是人类食用和药用的重要资源，具有丰富的营养成分和显著的抗癌、抗肿瘤等作用。郑义[9]、周凌云等[10]研究发现，东方栓孔菌多糖对小鼠具有降血糖、降血脂和护肝的作用；郝金斌等[11]发现奶油栓孔菌多糖具有抗氧化和保肝作用。因此，推测古巴栓孔菌多糖可能具有一定的药用价值。目前，我国大型真菌资源保护工作存在严重不足，物种受威胁程度评估近年来才刚刚起步[12]。另外，我国食药用菌种类繁多，目前人工驯化栽培成功的数量有限[13]。因此，探究野生大型真菌的生物学特征，对保护我国野生大型真菌种质资源具有指导意义。本研究拟通过探究古巴栓孔菌菌丝的生物特征，为开发古巴栓孔菌多糖的药用价值及野生食用菌的驯化、开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试菌种采自福建省厦门市热带植物园中的一颗倒伏枯树上，通过组织分离得到纯菌种，将其命名为TNCY002，现保藏在天津农学院食用菌研发中心。

1.2 培养基

斜面培养基（g/L）：马铃薯200，葡萄糖20，琼脂20，pH自然。

固体平板培养基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾 1，VB10.01，琼脂18，pH自然。

1.3 试验方法

1.3.1 培养基中碳源的筛选

以相同质量浓度的蔗糖、乳糖、可溶性淀粉和羧甲基纤维素钠代替固体平板培养基中的葡萄糖，其他成分不变。将培养基放至90 mm平板中，冷却凝固后，将母种接到不同碳源的培养基上，用接种铲将菌种切成1 mm左右的方块，菌块尽量放在平板正中间。每种碳源3次重复，观察对比菌丝的生长情况，筛选出最佳碳源。

1.3.2 培养基中氮源的筛选

以相同质量浓度的酵母浸粉、黄豆粉、硝酸铵和尿素代替固体平板培养基中的蛋白胨，其他成分不变。接种方法同1.3.1，观察对比菌丝的生长情况，筛选出最佳氮源。

1.3.3 培养基中碳源添加量的筛选

将1.3.1中筛选出的最佳碳源在固体培养基中的添加量设为5、10、15、20、25 g/L，其他成分不变。接种方法同1.3.1，观察对比菌丝的生长情况，筛选碳源的最佳添加量。

1.3.4 培养基中氮源添加量的筛选

将1.3.2中筛选出的最佳氮源在固体培养基中的添加量设为1、2、3、4、5 g/L，其他成分不变。接种方法同1.3.1，观察对比菌丝的生长情况，筛选氮源的最佳添加量。

1.3.5 培养基初始pH的筛选

将固体平板培养基初始pH值设为5、6、7、8、9，观察对比菌丝在不同pH培养基中的生长情况。

1.3.6 培养温度的筛选

将接种后的固体平板培养基分别置于20、25、30、35、37、40 ℃的培养箱中，观察对比菌丝在不同温度条件下的生长情况。

1.3.7 菌丝形态及生长速度的测定

用5 mm的打孔器在长满菌丝的PDA培养基边缘打孔，将菌块接种至不同碳氮源培养基上，在25 ℃避光条件下进行培养，每天定时观察菌丝的生长状态[14-15]，用十字交叉法测量菌丝的半径，菌落半径（cm）和生长时间（d）的比值为菌丝的生长速度（cm/d）[16-17]。记录菌丝体萌发时间、菌落颜色、生长势等培养性状[18-19]。每组重复3次，菌丝长满时拍照记录。

1.3.8 正交试验

选用L9（34）正交试验设计表（表1），从单因素试验中的最佳碳源、氮源和温度各个因素中筛选出最佳组合，确定培养古巴栓孔菌的最佳配方及培养条件。测定方法同1.3.5，每组试验重复3次。

表1 正交试验因素与水平

1.3.9 数据处理

采用SPSS 23.0软件和Excel进行数据处理和分析。

2 结果与分析

2.1 碳源对菌丝形态及生长速度的影响

古巴栓孔菌在不同碳源培养基上长满平板后的菌丝形态指标见表2。以菌丝生长速度为主要指标，菌落疏密度为参照指标，分析不同碳源对菌丝形态和生长速度的影响。结果表明，对菌丝生长速度影响从大到小依次为蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、羧甲基纤维素钠、乳糖。虽然菌丝在以蔗糖为碳源的培养基上生长速度最快，但菌丝较稀疏。在葡萄糖为碳源的培养基上菌丝生长状态较好，生长速度达到0.74 cm/d。综合考虑，选择葡萄糖为最佳碳源。

表2 不同碳源培养基上古巴栓孔菌菌丝和菌落生长状况

注：表中同列不同大写字母表示差异显著（＜0.01）；＋＋＋表示菌丝生长势强；＋＋表示菌丝生长势较强；＋表示生长势一般。下同

2.2 氮源对菌丝形态及生长速度的影响

古巴栓孔菌在不同氮源培养基上长满平板后的生长状态见表3。以菌丝生长速度为主要指标，菌落疏密度为参照指标，分析不同氮源对菌丝形态及生长速度的影响。结果表明，对菌丝生长速度的影响从大到小依次为酵母浸粉、硝酸铵、蛋白胨、黄豆粉、尿素，不同氮源间差异极显著。以酵母浸粉为氮源时，菌丝生长状态最好，菌丝生长速度达到0.9 cm/d。

表3 不同氮源培养基上古巴栓孔菌菌丝和菌落生长状况

注：表中－表示菌丝生长势较弱。下同

2.3 碳源添加量对菌丝形态及生长速度的影响

在不同碳源添加量的培养基上，观察分析古巴栓孔菌菌丝的生长状况，如表4所示。

表4 碳源添加量对古巴栓孔菌菌丝和菌落生长状况的影响

注：表中同列不同小写字母表示差异显著（＜0.05）

由表4可知，当葡萄糖添加量为5～20 g/L时，菌丝均可生长，碳源添加量对菌丝生长影响显著。葡萄糖添加量为5 g/L时，菌丝生长速度最快，达到1.2 cm/d。虽然葡萄糖添加量较高时，生长速度稍有降低，但菌丝致密、粗状、洁白，气生菌丝较多，菌丝活力较强。因此，可将菌丝生长速度、菌落疏密度、生长形态作为综合考察参考指标。

2.4 氮源添加量对菌丝形态及生长速度的影响

在不同氮源添加量的培养基上，以菌丝生长速度为主要指标，菌落疏密度为参照指标，观察分析古巴栓孔菌菌丝生长状况，如表5所示。由表5可见，当酵母浸粉添加量在1～3 g/L时，菌丝生长速度较好，碳源添加量对菌丝生长的影响极显著。酵母浸粉添加量为3 g/L时，菌丝的生长速度最快，达到1.17 cm/d。

表5 氮源添加量对古巴栓孔菌菌丝和菌落生长状况的影响

2.5 培养基初始pH对古巴栓孔菌菌丝生长状况的影响

古巴栓孔菌在不同初始pH培养基上长满平板后的生长状况见表6。菌丝在初始pH值为5、6、7、8、9培养基上生长速度没有显著性差异，说明培养基pH对古巴栓孔菌菌丝生长影响不大。

表6 培养基初始pH对古巴栓孔菌菌丝和菌落生长状况的影响

2.6 培养温度对古巴栓孔菌菌丝生长状况的影响

古巴栓孔菌在不同温度条件下的生长状况见表7。以菌丝的生长速度为主要指标，菌落疏密度为参照指标，观察分析古巴栓孔菌的生长状况。结果表明，温度对菌丝生长速度影响从大到小依次为35、37、30、40、25、20 ℃，各温度之间差异性极显著。在35 ℃条件下培养，菌丝生长状态最佳，菌丝生长速度达到1.02 cm/d。

表7 不同温度条件下古巴栓孔菌菌丝和菌落的生长状况

2.7 正交试验

正交试验结果见表8，试验结果方差分析见表9。由表8可见，每组试验重复3次。正交试验极差A＞C＞B，3因素对古巴栓孔菌菌丝生长的影响从大到小依次为葡萄糖、温度、酵母浸粉。试验最佳组合为A1B3C3，菌丝生长速度为1.44 cm/d。通过计算值，理论最佳水平组合仍为A1B3C3。

表8 正交试验结果直观分析表

注：1～3表示以菌丝生长速度为指标的对应水平总和平均值；表示各对应水平干重极差

表9 试验结果方差分析

注：表中a表示2＝0.796（调整后2＝0.735）

从表9可以看出，葡萄糖和温度的显著性小于0.01，说明葡萄糖对试验结果具有极显著影响。酵母浸粉显著性小于0.05，说明酵母浸粉对试验结果具有显著影响。A1B3C3为最好的试验组合。

2.8 正交试验验证

为检验正交结果的稳定性和可靠性，对A1B3C3组合进行试验验证，试验重复3次。3次测量的菌丝生长速度分别为：1.43，1.44，1.44 cm/d。3次试验菌丝生长速度的均值为1.43 cm/d，与正交结果基本一致，试验在误差范围内，故可以证明正交试验结果具有稳定性和可靠性。

3 结论

不同的多孔菌科类真菌对碳氮源的喜好各不相同，菌落的生长形态也不尽相同。毕旺华等[20]通过平板培养法对毛栓孔菌的营养条件进行筛选，得出最佳碳源为蔗糖[21-22]，这一结论与本研究结果相符。周永斌等[23]筛选出灰树花的最佳碳源为葡萄糖，菌丝生长速度为0.55 cm/d，此结果证明菌种不同，葡萄糖对菌丝生长的影响也不同。通过单因素试验得出，pH对古巴栓孔菌菌丝生长速度的影响不显著。碳源、氮源以及温度对其影响较大，最佳碳源、氮源分别为葡萄糖、酵母浸粉，最佳培养温度为35 ℃。正交试验结果显示，影响菌丝生长速度的因素从大到小依次为葡萄糖、酵母浸粉、温度。菌丝最快生长速度可达到1.44 cm/d。通过正交试验得到的最佳培养基配方为：葡萄糖15 g/L，酵母浸粉3 g/L，硫酸镁0.5 g/L，磷酸二氢钾 1 g/L，VB10.01 g/L，琼脂18 g/L，pH自然，36 ℃培养。在此最佳条件下进行验证试验，菌丝的生长速度达到1.43 cm/d，在试验误差范围之内，验证结论与正交试验结果基本一致。本研究结果对古巴栓孔菌菌种保藏具有指导意义，为菌丝胞内多糖[24]的开发利用奠定了理论基础。

[1]戴玉成，周丽伟，杨祝良，等. 中国食用菌名录[J]. 菌物学报，2010，29（1）：1-21.

[2] 李臻. 中国古代菌蕈文化中关于灵芝的记载[J]. 中国食用菌，2020，39（3）：129-131，134.

[3]秦淼. 野生食用菌资源利用现状及对策探究[J]. 南方农业，2019，13（Z1）：117-118.

[4]万涛. 野生食用菌资源利用现状及发展前景[J]. 河南农业，2019（10）：41-42.

[5] 袁江玲，雒婉霞，徐晓辉，等. 一株新疆罕见野生大型真菌的形态及分子生物学鉴定[J]. 疾病预防控制通报，2020，35（3）：14-17.

[6] 晚安琪，蔺晓云，黄亮，等. 一株侧耳属野生菌的分离鉴定及初步驯化栽培[J]. 天津农学院学报，2020，27（2）：28-30.

[7] 邱志伟，陈有忠，于奥安，等. 枣树根部内生细菌的分离及对3种枣病原真菌拮抗活性研究[J]. 天津农学院学报，2019，26（3）：12-16.

[8] 孙晓莉，高建，潘乐欣，等. 猪大肠杆菌性腹泻病的病原分离鉴定及药敏试验[J]. 天津农学院学报，2019，26（2）：57-60.

[9] 郑义. 东方栓孔菌多糖的分离纯化、结构解析与生物活性研究[D]. 徐州：中国矿业大学，2019.

[10] 周凌云，鲁斌，孙玉. 东方栓孔菌多糖对小鼠的降血糖和降血脂作用[J]. 南方医科大学学报，2020，40（8）：1127-1133.

[11] 郝金斌，孟国良，杨军，等. 奶油栓孔菌子实体多糖的理化性质、抗氧化活性与保肝作用[J]. 菌物学报，2020，39（12）：2355-2368.

[12]魏铁铮，王科，于晓丹，等. 中国大型担子菌受威胁现状评估[J]. 生物多样性，2020，28（1）：41-53.

[13] 卯晓岚. 我国野生食用菌的驯化选育近况[J]. 北京农业，2006（3）：19-20.

[14]杨慧，尚晓冬，王瑞霞，等. 蒸馏水与液氮保藏金针菇菌种特性的比较[J]. 食用菌学报，2010，17（4）：23-25.

[15]曲娜，刘迪，王皓，等. 长白山野生珊瑚状猴头菌菌丝最佳培养基配方研究[J]. 中国食用菌，2020，39（4）：17-19.

[16] 张琦，王航，刘琨，等. 干巴菌菌丝生物学特性及生长条件研究[J]. 贵州农业科学，2019，47（5）：55-60.

[17]孙厚静，谌金吾，闫静，等. 灰树花菌丝生长最佳培养基碳氮比研究[J]. 食用菌，2019，41（5）：18-20.

[18]杨焕玲，查磊，赵妍，等. 新型香菇母种培养基的筛选[J]. 江苏农业科学，2019，47（3）：124-126.

[19]田雪梅，宋爱荣. 温度对樟芝菌丝体生长的影响试 验[J]. 中国食用菌，2005，24（5）：51-52.

[20]毕旺华，田雪梅，孙效乐，等. 毛栓孔菌菌丝体生长营养条件的优化研究[J]. 青岛农业大学学报（自然科学版），2012，29（1）：51-54.

[21] KUDAHETTIGE R L，HOLMGREN M，IMERZEEL P，et al. Characterization of bioethanol production from hexoses and xylose by the white rot fungus[J]. Bioenerg Res，2012，5（2）：277-285.

[22] SHAKHOVA N V，GOLENKINA S A，STEPANOV A E V，et al. Effect of submerged cultivation conditions and inducers on biosynthesis of extracellular laccase by a1666 strain[J]. Appl Biochem Micro+，2011，47（9）：808-816.

[23]周永斌，张志军，刘连强，等. 白灰树花菌丝体最适营养生长条件的研究[J]. 中国食用菌，2010，29（6）：26-27.

[24]孙康迪，柳青云，方咏青，等. 黄芪多糖、灵芝多糖和转移因子对犬瘟热免疫效果的影响[J]. 天津农学院学报，2020，27（1）：58-60.

Studies on the biological characteristics of a wild

Shi Weili, Ban LitongCorresponding Author, Huang Liang, Yang Hongpeng, Sun Ning, Wang Yu, Li Yiting, Zhang Yi

（College of Agronomy and Resource Environment, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China）

In this experiment, a single factor and orthogonal test methods were used to study the optimal culture conditions of a wildhyphae. The single factor test results showed that the optimal carbon source and nitrogen source for the mycelium of Trametes cubensis were glucose and yeast extract powder, and the optimal addition amount of carbon source and nitrogen source were 5 g/L, 3 g/L. The optimum culture temperature was 35 ℃, and the initial pH of the medium had no significant effect on the growth of the hyphae ofOrthogonal test results showed that the order of the effects on the growth of the mycelium ofwas: carbon source＞temperature＞nitrogen source.The results of orthogonal test showed that the optimum medium was glucose 15 g/L, yeast extract 3 g/L, magnesium sulfate 0.5 g/L, monopotassium phosphate 1 g/L, VB10.01 g/L, Agar 18 g/L, natural pH, culture temperature 36 ℃.

; mycelial growth; temperature; carbon and nitrogen sources; orthogonal test

S646

A

1008-5394（2021）02-0031-05

10.19640/j.cnki.jtau.2021.02.006

2020-07-02

天津市蔬菜产业技术体系创新团队项目（ITTVRS2017015）

史维丽（1994—），女，硕士在读，研究方向为作物栽培学与耕作学。E-mail：975576049@qq.com。

班立桐（1972—），男，教授，学士，主要从事食用菌栽培研究。E-mail：banlitong@126.com。

责任编辑：宗淑萍