NFATc1对糖尿病动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠肠道菌群的影响

刘嘉， 孙振， 侯丽娜， 钱勇江， 邵晨， 袁伟， 王中群

(江苏大学附属医院心内科，江苏 镇江 212001)

随着社会经济的发展和人们膳食结构的改变，糖尿病发病率呈爆炸式增长，我国糖尿病患者数量现已位居世界首位，占全球总数的1/4以上[1-2]。心血管疾病是糖尿病患者致死致残的主要原因[3]。动脉粥样硬化是一种好发于大中等动脉、以脂质蓄积和炎症反应为特征的血管壁慢性病变，是心血管疾病的主要病理基础。现有证据表明糖尿病环境增加罹患动脉粥样硬化的风险[4]，然而其中机制目前尚未明确。因此深入探讨糖尿病动脉粥样硬化的发病机制具有十分重要的现实意义。人体内共生着大量的微生物，包括细菌、病毒、古生菌和真菌等，其中大多数定植于胃肠道。肠道微生物构成肠道黏膜屏障，对机体正常生理功能起着重要的维持作用，包括调节营养物质的吸收和代谢，避免糖脂代谢紊乱[5-6]，协助免疫组织成熟[7-9]，甚至影响神经生理及行为功能[8]等。最新研究结果表明，肠道菌群及其代谢产物如短链脂肪酸、氧化三甲胺、胆汁酸和脂多糖等，可作用于胆固醇代谢和免疫系统影响斑块的形成和破裂，影响动脉粥样硬化的发病进程[10]。既往研究表明活化T细胞核因子胞浆1型(nuclear factor of activated T-cells， cytoplasmic 1,NFATc1)在糖尿病患者血清中的含量显著升高[11]，且活化T细胞核因子(NFAT)在糖尿病小鼠的主动脉中被选择性激活[12]。课题组前期研究发现，NFATc1作为成骨破骨平衡的“分子开关”，影响了糖尿病大血管并发症的发生[13]。改变破骨细胞和成骨细胞的相对活性，可导致骨量减少甚至发生骨质疏松，这些疾病均与肠道微生态的紊乱密切相关[14]。但现有研究未见有关NFATc1影响肠道菌群结构的报道，因此本研究拟构建糖尿病动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠模型， 观察NFATc1对糖尿病动脉粥样硬化斑块的影响，运用16S rRNA技术探究NFATc1对肠道菌群纲水平的调节情况，希冀为防治动脉粥样硬化提供新的思路和方向。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

小鼠高脂饲料成分为10%猪油、4%奶粉、1.5%胆固醇、0.5%胆酸钠和84%普通饲料，购自江苏协同医药生物有限公司。NFATc1敲减腺相关病毒(AAV-shNFATc1)及阴性对照腺相关病毒(AAV-negative control)购于生工生物工程(上海)股份有限公司；链脲佐菌素(美国Sigma公司)；BCA蛋白定量试剂盒(南京诺唯赞公司)；NFATc1抗体(英国Abcam公司)；β-肌动蛋白抗体(美国Proteintech公司)；羊抗兔二抗(上海泊湾生物公司)；PVDF膜(德国Millipore公司)；苏木素-伊红染色(HE染色)试剂盒为索莱宝公司产品；组织包埋盒及载玻片购自江苏世泰实验器材有限公司。代谢笼(苏州泽雅科教实验设备有限公司)；电泳仪(美国Bio-Rad公司)；化学凝胶成像分析仪(美国GE Healthcare公司)；BM450A组织包埋机、BM450型组织包埋冷冻台、PH60型病理组织漂烘仪(常州派斯杰医疗公司)；手动轮转式切片机(德国Leica公司)；光学显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 糖尿病动脉粥样硬化小鼠模型构建和分组

SPF级6周龄雄性ApoE-/-小鼠购自常州卡文斯实验动物有限公司。自由摄食及饮水1周后，给予小鼠腹腔注射小剂量链脲佐菌素[40 mg/(kg·d)]，连续5 d。2周后将血糖水平≥300 mg/dL的小鼠随机分组如下：模型对照组(高脂饮食)、阴性对照组(高脂饮食+尾静脉注射AAV-negative control)、NFATc1敲减组(高脂饮食+尾静脉注射AAV-shNFATc1)。每组5只，连续饲喂8周。

1.3 切片制备

实验结束后处死小鼠，剥离出主动脉组织，使用4%多聚甲醛固定10 h，将组织置于脱水盒中，依次放入75%、75%、95%、95%乙醇缸内浸泡各 60 min，无水乙醇浸泡30 min(2次)脱水；然后放入二甲苯-无水乙醇等量混合液浸泡60 min、二甲苯浸泡60 min、二甲苯浸泡30 min透明；最后放入恒温箱中的石蜡-二甲苯等量混合溶液处理30 min，充分融化的纯蜡中浸蜡2次，各60 min。随后调整组织在包埋框的角度，使用包埋机加蜡包埋，并立即放置于-20 ℃冷冻台上冷却。待蜡凝固后修整蜡块，切片机切片，片厚4 μm，将切片漂浮于漂片机温水上展平，用载玻片将组织捞起，放入烘箱烤片。待水烤干，蜡烤化后，取出常温保存备用。

1.4 HE染色观察小鼠主动脉斑块形成情况

使用常温所存石蜡切片，脱蜡水化，苏木素染液染色10 min，自来水冲洗，分化液分化30 s，自来水浸泡15 min，置伊红染液染色1 min，自来水冲洗，自来水浸泡3 min，脱水，透明，封片后，镜下拍照。利用Image J软件分析测量各组照片，计算各组小鼠主动脉斑块相对面积(%)：主动脉斑块面积/血管面积。

1.5 蛋白质印迹检测小鼠主动脉NFATc1蛋白表达

提取小鼠主动脉组织蛋白，BCA法测定蛋白浓度。进行10% SDS-PAGE，70 V 120 min分离所提取的蛋白样品，350 mA 100 min电转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1.5 h，与一抗NFATc1、β-肌动蛋白(稀释比均为1 ∶ 1 000)孵育过夜，TBST洗3次，羊抗兔二抗孵育1 h，TBST洗3次，化学发光系统显示图像，使用Image J软件分析蛋白灰度值，计算蛋白相对表达量。

1.6 小鼠粪便样本收集

使用无菌代谢笼分离小鼠粪便和尿液，粪便排入干燥容器中，使用无菌镊子夹取中段新鲜粪便约0.2 g，放入无菌冻存管，管壁标记样品名称，液氮速冻，-80 ℃冰箱保存，所有样本收集完毕后干冰寄送至深圳微生太公司进行高通量测序。

1.7 小鼠粪便DNA抽提和PCR扩增

根据粪便基因组DNA提取试剂盒(美国Omega Bio-Tek公司)说明书进行总DNA抽提，DNA浓度和纯度利用NanoDrop 2000进行检测，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量；用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)引物对V3-V4可变区进行PCR扩增，扩增程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，27个循环；最后72 ℃延伸10 min(ABI GeneAmp®9700型PCR仪)。扩增体系：5×FastPfu缓冲液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，338F引物(5 μmol/L)0.8 μL，806R引物(5 μmol/L)0.8 μL，FastPfu聚合酶0.4 μL，BSA 0.2 μL，DNA模板10 ng，补双蒸水至20 μL。

1.8 Illumina MiSeq测序

使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(美国Axygen Biosciences公司)进行纯化，Tris-HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测。利用QuantiFluorTM-ST(美国Promega公司)进行定量检测。根据Illumina MiSeq平台标准操作规程将纯化后的扩增片段构建文库。利用MiSeq PE300平台进行测序。以99%的序列相似度作为操作分类单元(OTUs)划分阈值，根据聚类结果对OTUs进行物种注释，得到物种信息后进行Alpha多样性分析，对纲水平(Class)丰度排名前20的物种进行生物信息学分析。

1.9 统计学分析

应用微生物组成分析(analysis of composition of microbiomes, ANCOM)分析菌群在组间的差异显著性，由ANCOM分析生成的W值是某一菌群在组间检验中存在显著差异的个数，高W值表明拒绝无效假设的可能性更大。clr值指某一菌群相对丰度的组间差异程度，绝对值越高代表相对丰度差异越大。

2 结果

2.1 NFATc1敲减效率验证

将NFATc1敲减腺相关病毒尾静脉注射进小鼠体内，并高脂饮食饲喂8周后， 蛋白质印迹结果显示，主动脉中NFATc1蛋白表达明显低于阴性对照组(t=6.62，P<0.05)，而模型对照组和阴性对照组小鼠主动脉NFATc1的表达无明显差异(t=0.35，P>0.05)。见图1。

*：P<0.05，与阴性对照组比较

2.2 敲减NFATc1后糖尿病ApoE-/-小鼠主动脉HE染色结果

HE染色结果表明，糖尿病ApoE-/-小鼠高脂饲喂8周后主动脉粥样斑块形成，且结构发生改变：中膜平滑肌层变薄，内膜受损且有大量胆固醇结晶堆积，纤维帽下聚集大量炎症细胞。结果表明成功构建糖尿病动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠模型。与阴性对照组相比，NFATc1敲减组斑块相对面积明显减小(t=8.28，P<0.05)。而模型对照组与阴性对照组间主动脉斑块相对面积差异无统计学意义(t=0.20，P>0.05)。见图2。

A：HE染色(×100)；B：主动脉斑块定量分析；*：P<0.05，与阴性对照组比较

2.3 16S rRNA PCR扩增产物鉴定结果

阴性对照组与NFATc1敲减组小鼠粪便样品的16S rRNA PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示。两组小鼠粪便共10个样本，PCR产物目的条带大小正确，浓度适中，可以进行下一步的测序。

图3 小鼠粪便样本16S rRNA PCR扩增产物质检结果

2.4 Alpha多样性稀释曲线

如图4所示，两组样本的Alpha多样性指数稀释曲线趋于平缓，测序深度已经基本覆盖到样品中的所有物种，可以认为增加测序深度并不能获得更多新的OTUs，说明测序数据量达到要求，测序结果已足以反映样本中物种群落的丰富度及多样性，可以进行后续数据分析。

A：菌群丰度指数稀释曲线；B：菌群多样性指数稀释曲线

2.5 NFATc1对糖尿病动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠纲水平肠道菌群相对丰度的影响

Illumina MiSeq测序结果显示，糖尿病动脉粥样硬化小鼠粪便中共检测到17个菌纲，见图5。阴性对照组中相对丰度大于0.1%的菌纲有9个，其中相对丰度大于10%的菌纲有4个，分别是产芽胞菌纲(32.93%)、放线菌纲(25.55%)、芽孢杆菌纲(19.44%)、梭菌纲(14.09%)，它们是该组小鼠粪便中的优势菌群。NFATc1敲减组小鼠粪便中产芽胞菌纲的相对丰度增至78.82%，而上述其余3个菌纲相对丰度均较阴性对照组下降。提示NFATc1对小鼠纲水平肠道菌群的主要构成无影响，但菌群相对丰度发生了变化。

A：各样本在纲水平的菌群相对丰度(相对丰度前20的物种)；B：阴性对照组与NFATc1敲减组在纲水平的菌群相对丰度；在纲水平没有注释的序列被归为“其他”一类。个别未译英文菌名暂无合适中文译名

基于ANCOM方法对组间OTUs进行差异显著性分析，见图6。在NFATc1敲减后，芽孢杆菌纲(W值=5，clr=-2.27)相对丰度水平降低，且具有较高的显著性差异。产芽胞菌纲(W值=2，clr=1.39)、β-变形菌纲(W值=2，clr=1.54)、柔膜菌纲(W值=2，clr=1.61)相对丰度升高，TM7_3(W值=2，clr=-1.41)相对丰度降低，以上菌纲在组间均有显著差异。而放线菌纲(W值=1，clr=-0.59)及红蝽菌纲(W值=1，clr=0.89)虽在组间具有显著性差异，但权重较小。

图中每一个点代表一个菌群，“其他”类菌群未参与该分析。W值越高，组间的差异显著性越高；clr值的绝对值越高代表相对丰度差异越大。

3 讨论

糖尿病动脉粥样硬化的发病机制十分复杂，不仅与糖脂代谢紊乱有关，还涉及氧化应激、炎症反应、胰岛素以外的激素变化等[15]。进一步研究显示肠道菌群亦参与动脉粥样硬化的发生发展。肠道菌群被认为是调节人体健康的“第二大基因组”，并被称作虚拟的“内分泌器官”，其产生的分子能够参与宿主的多种生理代谢过程[16]。肠道菌群失调导致肠黏膜通透性增加，革兰阴性菌外膜上脂多糖成分进入血液循环。脂多糖可直接与免疫细胞表面Toll样受体4结合，抑制肝X受体，减少三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)和三磷酸腺苷结合盒转运体G1(ABCG1)的表达[17]。其次，脂多糖还可间接触发肿瘤坏死因子-α、白介素-1β的释放，抑制胆固醇逆转运，进而促进泡沫细胞的形成[18]。研究发现，肠道菌群的代谢产物氧化三甲胺可缩小体内胆汁酸池，导致胆固醇外流减少，促进动脉粥样硬化的发展[19-20]。此外，研究发现约51.5%的患者动脉粥样硬化斑块中检测出细菌DNA，其中部分来自肠道或口腔[21]。细菌进入动脉粥样硬化斑块的机制之一是巨噬细胞在上皮细胞层(如肠道、口腔和肺)的吞噬作用。被感染的巨噬细胞扩散并迁移进入内膜，转化为含胆固醇的泡沫细胞[22]。这表明菌群本身及其代谢产物可能直接参与动脉粥样硬化的发生。Hooper等[23]研究表明接种拟杆菌能促进宿主回肠脂肪吸收关键酶的表达，增强肠细胞对脂质的吸收，加重脂肪沉积。而Turnbaugh等[24]发现，无菌鼠无论接种拟杆菌或厚壁杆菌，体脂肪均有所增加，只是厚壁杆菌影响更大。近年来研究显示，灌胃拟杆菌可降低ApoE-/-小鼠粪便和血浆中脂多糖浓度，并延缓小鼠血管动脉粥样硬化的发生[25]。以上研究表明，改变肠道微生物的构成会影响包括脂质代谢在内的多种过程，但研究结果不一致的原因可能在于肠道各菌群发挥作用的复杂性。

NFATc1作为NFAT转录因子家族的重要成员之一，调节破骨细胞的形成和分化，维持骨组织动态平衡[26]。抑制NFATc1转录活性，可延缓小鼠骨质疏松的发展[27]。最新研究发现骨质疏松症患者肠道菌群多样性降低且发生失衡，特别是乳杆菌和产丁酸菌的丰度较低，致病性细菌梭状芽胞杆菌丰度增加[28]。一项横断面研究显示[29]，与健康人群相比，牙周炎患者牙龈组织中NFATc1表达显著升高，且表达量随着疾病严重程度的增加而增加。同时牙周炎患者的肠道菌群丰度有所下降，其中厚壁菌门、变形菌门、疣微菌门比例增加，而拟杆菌门比例下降[30]。Lucas等[31]对小鼠喂食短链脂肪酸丙酸酯和丁酸酯，结果显示小鼠的骨含量显著增加。且体外研究发现二者显著抑制了破骨细胞信号转导成分NFATc1的表达。这些实验表明NFATc1与肠道菌群的构成密切相关。Sun等[32]发现，肠道菌群中的产芽胞菌纲在治疗非酒精性脂肪肝中发挥了重要作用。间歇性禁食后产芽胞菌纲显著富集，肠道微生物丰富度增加，有助于预防肥胖症和多种代谢相关性疾病[33]。而梭菌纲是唯一一种在肥胖动物肠道中显著增加的菌群[34]。本研究在干扰NFATc1表达后，敲减组的特征微生物产芽胞菌纲相对丰度显著增加，而放线菌纲、芽孢杆菌纲、梭菌纲相对丰度降低。结果提示NFATc1可致糖尿病小鼠肠道菌群的相对丰度发生改变，其中产芽胞菌纲及梭菌纲可能与脂质代谢相关。然而，NFATc1是否介导产芽胞菌纲或肠道菌群代谢产物，影响糖尿病动脉粥样硬化进程，还需要进一步的实验加以研究。

综上所述，本研究结果表明，干预NFATc1的表达后糖尿病ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块面积明显减小，同时肠道菌群中产芽胞菌纲的相对丰度明显增加，放线菌纲、芽孢杆菌纲、梭菌纲的相对丰度降低。以上结果提示NFATc1可改变糖尿病动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠肠道菌群的相对丰度，而动脉粥样硬化的进程可能与肠道菌群的相对丰度变化相关，这将为糖尿病大血管并发症的防治提供新的靶点。