肉制品中亚硝化反应的控制措施和检测方法研究进展

任顺成，胡海洋

河南工业大学 河南省天然色素制备重点实验室，河南 郑州 450001

在腊肠、火腿等肉制品生产过程中，会添加一定量的亚硝酸盐和硝酸盐。亚硝酸盐在酸性条件下分解生成的亚硝基可以与肉制品中肌红蛋白或血红蛋白反应，生成亮红色的亚硝基肌红蛋白或亚硝基血红蛋白，因而使肉制品呈现粉红色，赋予肉制品诱人的色泽，即发色作用[1-2]。另外，亚硝酸盐还能抑制肉毒梭状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等致病菌的生长繁殖，起到抑菌防腐的作用[3-5]；同时，亚硝酸盐可以抑制油脂氧化，能够作为抗氧化剂应用于食品中，保障了产品的质量[6]。亚硝酸盐的适量摄入对人体心血管系统还颇有好处，因为亚硝酸盐本身是一种血管扩张剂，能够在人体内畅通血管、改善血流，并且帮助人体控制血压[7]。正是基于亚硝酸盐拥有这些无法取代的作用，一些生产者往往不按照标准使用，过量摄入致使食物中毒卫生安全事件常有发生。

1 亚硝酸盐和亚硝胺的危害

1.1 亚硝酸盐

亚硝酸盐广泛存在于水域、植物及许多食物中，它可以在食品和人体中较容易地由硝酸盐进行转化。亚硝酸盐的主要食物来源包括腌肉和谷类，而人类摄入的亚硝酸盐中约有90%是由口腔中硝酸盐的转化而产生，这主要是通过口腔中硝酸盐还原酶的作用实现[8]。亚硝酸盐能与血红蛋白相互作用，通过Fe2+氧化成Fe3+形成高铁血红蛋白，从而阻止或降低血液输送氧气的能力，这种情况被描述为高铁血红蛋白症，尤其是在婴儿中(即蓝婴综合征)频繁出现[9-10]。在胃中，亚硝酸盐和仲胺之间的反应会导致亚硝胺的形成，而亚硝胺被认为是致癌、致畸和致突变的，增加了人体患胃癌和食道癌的风险[11-13]。NaNO2作为N-亚硝胺的前体物质具有很强的遗传毒性和致癌性，被WHO列入2A类致癌物，一般人体摄入0.3～0.5 g亚硝酸盐便可引起中毒，超过3 g则会致死[7]。其中硝酸盐的每日可接受摄入量为人体重的3.7 mg/kg，亚硝酸盐的每日可接受摄入量为人体重的0.06 mg/kg[14]。

1.2 亚硝胺

亚硝胺是一种具有很强毒性的化学物质，可诱使有机体发生基因突变，具有致畸性和强致癌性，胃癌、食道癌等均与亚硝胺的摄入有一定关系。亚硝胺在机体内的代谢主要是通过羟基化途径进行的，经过羟基化代谢之后，会生成强致癌物质烷基重氮离子，它能使DNA、RNA及蛋白质发生烷基化作用，引起机体各器官的癌变。研究表明亚硝酸盐与生物胺(如尸胺、腐胺)和蛋白质氧化降解的产物(如谷氨酸、丙氨酸)都可以产生亚硝胺[15]。其中仲胺与亚硝酸盐发生亚硝化反应的速度最快，但在有硫氢酸根存在的条件下(譬如人的唾液)，伯胺和叔胺与亚硝酸盐的反应也会加快，同时胃部的酸性环境对亚硝化反应的进行非常有利，即使胃液中含有少量的亚硝酸盐和胺类物质，仍会有相对较多的二甲基亚硝胺(NDMA)生成[2]。目前亚硝胺的理论研究模型通常采用模拟胃液体系(pH 3.0，温度37 ℃)，并加入二甲胺(DMA)、亚硝酸盐等前体物质和磷酸盐缓冲液。如二甲胺与亚硝酸盐在弱酸环境下可以形成NDMA，其主要生成途径是两分子HNO2生成活性中间体N2O3，再由DMA经过亚硝化步骤生成NDMA。

2 影响亚硝化反应的因素

在生产过程中，肉制品中亚硝酸钠的添加量是其残留量的决定性因素，国家标准规定肉制品中亚硝酸钠残留量不应超过0.03 g/kg，但实际上在原材料里加入的亚硝酸钠低于规定的最大使用量0.15 g/kg，肉制品中的亚硝酸钠残留量也会存在超标现象。影响亚硝酸钠残留量和亚硝胺生成的因素主要有原料肉的肥瘦比例、原料肉的新鲜程度、加工工艺、天然物质的添加等。理论上亚硝化反应最适pH 值为3.0～4.0，在pH值过低的情况下不能生成亚硝胺，过高则反应速率变慢[15]。原料肉中的瘦肉占比较大时，能提供充足的乳酸和肌红蛋白与亚硝基发生反应，从而消耗更多的亚硝酸盐，相应地，亚硝酸盐的残留量与亚硝胺含量也就会降低[16]。肉制品生产工艺的不同，也可能导致亚硝酸盐残留量和亚硝胺含量增加，油炸、熏烤肉制品中亚硝胺含量更高，而微波加热亚硝胺含量较少。同时腌制温度高、时间短，残留量就会相应增加[17]。研究表明，食品中含有的维生素C、植物提取物、多酚等物质也可以影响亚硝化反应的进行。在健康志愿者饮用葡萄酒后，测量其胃内排出的气体中含有大量一氧化氮，证实了葡萄酒能够促进一氧化氮的产生。维生素C和咖啡酸在亚硝酸盐还原为一氧化氮的过程中起协同作用。从机理上来说，一氧化氮的形成与亚硝酸盐的单价还原有关，亚硝酸盐的还原主要取决于酚的结构，并且在这一过程中形成了酚的硝基衍生物[8]。

3 亚硝化反应的控制措施

随着食品行业的快速发展，政府和人民对食品安全也更加关心。提高食品的质量与安全问题迫在眉睫。

3.1 添加天然提取物

目前，大多选择添加天然物质来干扰亚硝化反应。桐花树[18]、姜[19]、桔梗[20]、橘核[21]、苹果[22]等植物提取物对亚硝酸盐均具有良好的清除作用。Vivar-Vera等[23]在猪肉、火鸡肉的混合物中添加了杨桃膳食纤维浓缩物，使维也纳香肠的抗氧化能力上升、亚硝酸盐含量大幅度降低。刘星[24]研究了山楂和洋葱提取物对亚硝酸盐清除率的影响，对比黄芪等14种天然植物清除亚硝酸盐的效果，结果表明山楂和洋葱提取物的亚硝酸盐清除率较高，分别达到94.25%、84.50%，清除效果较好。

3.2 利用生物方法

利用生物方法可降解亚硝酸盐从而减少亚硝胺的生成[25-27]。He等[28]研究了低温好氧反硝化菌黄山假单胞菌J488，在15 ℃时能够有效去除废水中的多种氮源，对氨氮、硝酸盐和亚硝酸盐的去除率分别为100%、92.61%和92.49%。He等[29]则发现了一种低温好氧假单胞菌菌株Y-11对硝酸盐和亚硝酸盐表现出较高的去除能力，当菌株Y-11在15 ℃条件下培养4 d，初始氨氮质量浓度为209.62、204.61、204.33 mg/L (pH 7.2)时，硝酸盐和亚硝酸盐的去除率分别为93.5%和81.9%，相应的去除速率分别达到1.99、1.74 mg·L-1·h-1。但利用生物方法的研究还不够完善，有待进一步发展。

3.3 使用多酚及其复配

多酚是植物的次生代谢产物，作为安全的天然产物，多酚普遍存在于植物组织中，是人类膳食的重要组成部分。同时多酚作为抗氧化剂、抗诱变剂、自由基清除剂等受到研究人员和食品制造商的广泛关注。在泡菜、肉制品中加入一定量的多酚可以有效阻断亚硝胺的生成，并且能够直接消减亚硝酸盐，具有良好的线性清除关系。多酚类物质在消化过程中可能与其他物质竞争亚硝化反应，并进一步阻止胃中亚硝胺的生成[30]。

研究表明，红酒中含有的槲皮素、儿茶素等多酚可将亚硝酸根离子还原为NO，有效清除了口腔和胃中的亚硝酸盐[31-32]。大豆酚类物质可能通过加速亚硝酸盐的减少，干扰酸性环境中NO的代谢，其亚硝酸盐还原活性与酚类物质含量呈正相关[33]。添加硒酵母和茶多酚的基础日粮可以有效提高武昌团头鲂的抗亚硝酸盐能力，同时两者的联合使用也比单独添加硒酵母或茶多酚更有效[34]。Li等[35]研究了绿茶、葡萄籽多酚和抗坏血酸对干腌香肠成熟过程中的pH值、水分活度、微生物数量、硫代巴比妥酸反应产物(thiobarbituric acid reactive substances, TBARS)、亚硝酸盐和亚硝胺残留量的影响，TBARS和亚硝胺含量在香肠成熟过程中呈上升趋势，但随着植物多酚和抗坏血酸的添加而显著减少。植物多酚和抗坏血酸能显著降低亚硝酸盐的残留量，其中抗坏血酸效果最好。结果表明，植物多酚和抗坏血酸能有效地保持干腌香肠的质量和安全性。在模拟胃液条件下，Veljovic-Jovanovic等[36]研究了(+)-儿茶素和槲皮素与亚硝酸反应的相互作用。亚硝酸与(+)-儿茶素反应产生的一氧化氮可进一步转化为6，8-二硝基儿茶素，槲皮素则部分抑制二硝基儿茶素的形成。此外，6，8-二硝基儿茶素可被亚硝酸氧化为醌类自由基，而槲皮素能明显抑制醌的形成。儿茶素和原花青素的氧化会导致亚硝基化合物的形成，绿原酸的氧化也会导致硫氰酸盐共轭的形成，绿原酸、儿茶素、原花青素的氧化速率依次增大，其中二硝基化合物的产生被认为是由于在儿茶素和原花青素的自由基中加入了一氧化氮[37]。研究表明，原花青素、表儿茶素没食子酸酯的高亚硝酸盐还原活性可能是因为以下因素：容易产生半醌、存在酚类偶联、酸性pH值容易引起分子共振的变化[33, 38]。其中，原花青素和儿茶素基于B环中的邻苯二酚结构、C环中的3位羟基，以及具有最大清除自由基活性的5-OH和7-OH的存在，对亚硝酸盐的清除起到了重要作用[39]。

3.4 其他方法

添加化学合成物质或者一些能起到类似亚硝酸盐发色或防腐作用的物质也可以减少其残留量。研究表明，山梨酸盐、次磷酸盐、红曲色素、氨基酸和肽等物质与亚硝酸盐共同作用，可以降低亚硝酸盐添加量，进一步减少亚硝胺的生成量[40-42]。

4 亚硝化反应的检测方法

检测亚硝化反应的方法较多，目前研究成熟的技术主要为光谱法和色谱法两大类。根据要求与条件可以选择不同的方法，在检测条件允许的情况下，可以使用气相色谱法或高效液相色谱法。如果是追求快速检测，可以使用光谱法中的分光光度法。

4.1 光谱法

光谱法中常见的检测方法为紫外分光光度法，该方法的原理是在弱酸条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色物质，在540 nm波长下测定吸光度。而亚硝胺的测定则是利用亚硝胺的光化学反应，在紫外光照射下，分解为亚硝酸根离子，经重氮化后，与α-萘胺偶合生成红色化合物，测定其吸光度。Masic等[43]首次研制了一种浸没式原位紫外传感器，建立了紫外吸收光谱与尿亚硝酸盐浓度之间的关系。进一步分析表明，硝化尿液中悬浮物对亚硝酸盐测定的影响较小，由于尿亚硝酸盐浓度过高而导致的饱和度严重影响模型的性能，这表明稀释是一个必不可少的样品准备步骤。Ozdestan等[14]利用分光光度法对土耳其爱琴海地区10种绿叶蔬菜中硝酸盐和亚硝酸盐含量进行检测。首次对野萝卜、菊苣、茴香、福蓟、蓝锦葵和甜菜进行了分析，被测蔬菜的亚硝酸盐含量小于26.33 mg/kg，回收率达到95.7%。同时利用高效液相色谱法对所建立的分光光度法进行了验证，两种方法对蔬菜中硝酸盐和亚硝酸盐含量的测定结果相同。分光光度法测定亚硝酸盐具有方法简便、快速、成本低等优点。

4.2 色谱法

色谱法检测亚硝化反应的常用方法为高效液相色谱法(HPLC)[44-47]、气相色谱法(GC)[48-50]、液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)[51]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[52-53]等。杨宁等[54]使用HPLC-MS检测腌菜中9种N-亚硝胺，回收率达75.7%～116.0%，检出限为0.20～0.49 mg/L。GC-MS用在亚硝胺检测中亦具有较高的准确率及灵敏度，其在检测限度内，灵敏度可达到10-9水平，Yurchenko等[55]利用气相色谱-质谱联用技术测定了386个肉制品中的5种挥发性亚硝胺。国外研究人员通过使用2个不同检测器的高效液相色谱法对亚硝酸根离子进行检测，在没有去蛋白的情况下，使用0.02 mol/L高氯酸钠水合物作为洗脱剂溶液，分析人血浆中的阴离子。在pH 3.9下，有机物质不会影响分析[56]。Lu等[57]采用分散液-液微萃取和高效液相色谱-荧光检测技术测定了5种亚硝胺(亚硝基吡咯烷、亚硝基二甲胺、亚硝基二乙胺、亚硝基二苯胺和亚硝基二乙胺)，该方法成功地应用于6个样品(泡菜、腌制香肠、熟酱油牛肉、啤酒、咸蛋和油炸鲭鱼)中，在0.01～0.07 μg/g范围内具有较低的检出限。色谱法检测结果准确、灵敏度高，但是价格昂贵，得不到普遍的应用。

4.3 其他方法

5 总结与展望

对目前研究亚硝化反应的几种主要的影响因素、控制措施和检测方法分别进行了论述。关于影响亚硝酸盐残留量和亚硝胺生成因素的研究较为完善，但亚硝化反应的控制措施和检测方法还有待发展。其中，检测方法多采用紫外分光光度法、液相色谱法和气相色谱法，适合实验室使用，但是现场快速检测技术还有待进一步发展。在食品生产过程中，各个研究机构多从蔬菜、水果等植物中提取抗氧化成分进行研究，对于不同食源多酚及其协同作用和相应的反应机理，学术界的研究还有待加强，应用到肉制品加工中也较为少见，应引起重视。膳食多酚是复杂的天然化合物，对人体具有公认的健康益处。研究不同类型的多酚对亚硝化反应的影响，并对多酚与亚硝化反应的机理进行探讨，这可以为维持和提高食品安全提供更多的理论基础，也是拓宽多酚类功能食品的开发与生产的必要过程。