尿蛋白组学现代化检测技术及其在运动中的应用

杨 玲, 林文弢

(1.韶关学院,广东 韶关 512005; 2.珠海科技学院,广东 珠海 519041)

尿蛋白组学是一门快速兴起的新学科,也是当今运动生物化学研究的新领域,尿蛋白组学研究已成为运动训练的一个新热点[1]。开展尿蛋白组学研究,探索蛋白组学的现代化测试与评价方法,有助于我们更好地理解运动训练的原理,寻找过度疲劳早期诊断的特异性生物学标志、运动训练的科学监控手段与运动能力的评价方法,保障优秀运动员身体健康,提高其运动能力。本文通过分析运动性尿蛋白的测试与评价方法,介绍尿蛋白组学的最新检测技术与应用,为科学的运动训练提供依据。

1 运动员尿蛋白测试与分析

运动员尿液中含有大量物质代谢的终产物和其他物质,这些物质反映运动员体内的基本情况,包括身体机能状况、对运动训练的适应程度,也可评定运动员的运动能力[2]。因此,科学测定和分析尿液成分非常重要。然而,尿液成分测试的影响因素较多,测试结果受检测仪器和方法的限制,如最早的尿蛋白测试仅仅是定性分析和半定量分析。随着科技的发展,尿蛋白检测技术越来越先进,分辨率越来越高,测试结果也从一种尿液总蛋白到目前的近万种尿蛋白类型。利用现代化尿蛋白检测技术与方法,能更科学地评定运动员的运动能力。

1.1 尿蛋白定性检测

磺基水杨酸法、试纸法、醋酸加热法和考马斯亮蓝法是尿蛋白定性检测的常用方法(表1)。在正常情况下,尿蛋白定性测试呈阴性,但容易受到一些因素干扰,致使结果呈假阳性。如：尿酸盐含量高时,尿呈酸性反应,蛋白试纸法结果较实际情况低;如果运动员大量使用青霉素,磺基水杨酸法易呈假阳性反应;当尿呈强碱性时,尿蛋白定性检测假性结果更多。因此,进行尿蛋白定性检测时,应综合各种因素选择最适宜的方法,若有条件最好进行定量检查。

表1 尿蛋白定性检测常用方法

1.2 尿蛋白定量检测

24 h尿蛋白排出量、单次尿单位体积中蛋白质含量、尿蛋白与肌酐的比值是尿蛋白定量检测常用的3种表达方式。单次尿单位体积中蛋白质检测方法简单,但受尿浓缩和稀释的影响,准确性差;24 h尿蛋白排出量虽然不受尿比重影响,但留取24 h尿液的准确性直接影响检测结果,尿中蛋白质的排出率也受受试者运动强度和用药等因素的影响[3];运动训练中常用尿蛋白与肌酐的比值反映运动负荷对机体的影响。

2 尿蛋白组学测试技术

尿蛋白组学概念的提出为高通量、高效、准确、灵敏地从整体角度研究运动与尿液蛋白质组分的关系提供了较好的平台。目前尿蛋白质组学研究常用的分析技术[4]如表2所示。其中,双向凝胶电泳(2-DE)和质谱(MS)联用分析是最常见的技术方法。不同技术各有其优势和局限,近年来,串联质谱分析方法的应用大大提高了检测结果的可靠性。

表2 不同蛋白质组学分析技术比较

2.1 双向凝胶电泳(2-DE)技术

2-DE技术是根据蛋白质等电点不同在pH值梯度胶中等电聚集将其分离,然后按照分子量大小在垂直或水平方向进行凝胶电泳(SDS-PAGE)第2次分离。由于pH值梯度不稳定,重复性差,对细胞内的低拷贝小蛋白、极端酸性蛋白或碱性蛋白、分子量过大或过小蛋白、难溶蛋白(包括膜蛋白)等的电泳分离和检测较难实现。2-DE一般只能分辨1 000～3 000个蛋白质点。

2.2 相对和绝对定量同位素标记(iTRAQ)技术

iTRAQ技术将同位素标记法与串联质谱技术相结合,能够高通量地寻找不同蛋白质组的差异蛋白并准确进行相对或绝对定量,可检测到的蛋白包括胞浆蛋白、线粒体蛋白、膜蛋白和核蛋白。同时,也能对不同类型的蛋白质进行鉴定,包括高分子量,酸性、碱性蛋白质等,但它一次最多只能上机10个样本,通量相对受限。

2.3 数据非依赖性采集(DIA)技术

DIA技术融合了传统蛋白质组学“鸟枪法”和质谱绝对定量“金标准”,通过液相色谱和质谱联用技术(LC-MS/MS)对样本进行全范围扫描,从若干个窗口高速、循环地对质谱中特定质量范围内的所有母离子进行碎裂、检测,从而无遗漏、无差异地采集所有母离子的碎片离子信息进行蛋白定性和定量分析,实现蛋白质的深度覆盖和精准定量。

3 尿蛋白组学技术在运动训练中的应用

运动训练可引起机体内环境、离子浓度、代谢物、营养状态等发生一系列改变,进而影响相关基因表达和蛋白质合成,也会使运动前后蛋白质组图谱出现差异。不同水平运动员对运动训练的应答性反应不同,蛋白质图谱表达也有所差异。

3.1 评定不同运动负荷

运动引起的正常人尿液中蛋白质含量增多但在数小时后消失,称为运动性蛋白尿。运动性蛋白尿排出的数量和成分可作为评定运动员身体机能状态、负荷强度和负荷量的指标。

3.2 运动性疲劳标志物

有训练就有疲劳,适度疲劳可以刺激机体超代偿恢复,提高运动能力,过度运动疲劳会损害身体健康,严重影响运动能力。通过尿蛋白组分变化检测与分析,可寻找运动性疲劳的生物标志物。

对比不同强度跑台运动前后尿蛋白组分的变化,发现载脂蛋白A1和锌α2-糖蛋白与能量代谢相关,在降低体重、减少脂肪含量及调控能量代谢方面有重要作用。研究[9]发现,剧烈运动后尿液中的锌α2-糖蛋白排出量增加了20倍,可能是因为高强度、长时间运动引起机体乳酸堆积,疲劳加深,为了满足运动时能量的需求,引起锌α2-糖蛋白合成率增加,促进脂肪分解,加强能量供应。应用双向电泳质谱技术在长距离耐力运动后尿液中也检测出锌α2-糖蛋白。这提示锌α2-糖蛋白可能与运动疲劳有关,其是否能作为运动疲劳的监测蛋白还需深入研究。可见,尿蛋白组学的检测和分析可以更好地监控运动训练。

3.3 运动员体能生化评定

不同运动的应激程度造成身体机能状态不同,产生的尿蛋白组分改变也存在差异[10]。一次大运动量训练后,尿蛋白少,表明机能状态较好;尿蛋白排出量增多,但4 h后或次日晨完全恢复到安静时水平,表明机体适应此负荷;如果次日晨尿蛋白仍不减少或增加,表明运动负荷太大,机体不适应,要适当减少运动量和强度。运动后尿蛋白恢复快,表明运动员恢复状态较好。在一个训练周期中,可以用尿蛋白作为监测指标,观察运动员对训练负荷的适应情况。在大运动量训练过程中,训练开始阶段身体不适应时,尿蛋白排泄量增多;继续一段训练后,完成相同强度的练习时,尿蛋白又会减少,这是身体适应运动量的表现。如果尿蛋白不减少或增加时,就需注意运动员的身体状态,减少训练强度或训练量。

综上所述,尿蛋白组学技术能够比较全面、综合地分析运动对机体的影响,打破以往仅研究几个蛋白质的局限,为揭示机体适应运动刺激的变化机制提供了新的视野和研究动向,为运动训练的监控提供了更好的平台,如图1所示。

图1 尿蛋白组学方法及应用示意

4 尿蛋白组学技术在运动训练中的展望

目前,尿蛋白组学技术在医学和体育学的研究中起着越来越重要的作用。利用生物信息技术对蛋白组学的各种数据进行处理和解析,也可对已知或新的基因产物进行全面分析,从而科学鉴定、分析蛋白质在不同条件下的表达水平,寻找疾病早期诊断的特异性生物学标志。因此,蛋白组学的鉴定与分析在临床早期诊断、疗效判断、病程监测、药物靶点开发、运动负荷评定、运动性疲劳检测等方面有重要意义和广阔前景。

我国科学家对健康人尿蛋白质组的生理波动性和个体间差异进行了系统评估,在此基础上建立了世界上首个蛋白质组规模的健康人尿蛋白定量参考范围。健康人尿蛋白定量参考范围在健康监测、肿瘤筛查及过度疲劳研究等方面具有重要的应用价值,从染色质的结构和功能、遗传信息及组蛋白密码动态变化对基因功能的调节机制等方面深入了解疾病的发生机理、靶向性药物开发乃至个体化治疗等,也为深入了解运动疲劳、提高运动能力开辟了新的方向。

5 小 结

近几年,我国对尿蛋白组学技术在运动中的应用进行了较为详细的研究,但均停留在运动后的变化研究上,对不同项目运动后尿蛋白组学的图谱研究、过度运动疲劳的尿蛋白标志物筛选及尿蛋白评定运动能力等相关研究尚少。随着运动科学的进一步发展,尿蛋白检查技术的先进化与普及化,其一定会发挥更大的作用。