七味白术散总苷含量测定方法的探索与优化

唐 圆，刘海会，黄莉莉，谭周进，谢果珍

（湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

苷类化合物是中药的一类重要成分，有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、提高免疫等药理作用[1-2]，因此，研究者们常将总苷作为中药复方的有效部分进行提取分离及药理药效研究。总苷的含量测定是评价提取工艺及制定质量标准的重要内容。然而，苷类化合物由糖或糖的衍生物与苷元通过糖苷键连接而成，苷元的种类繁多，所连接糖基的类型及数量各异，因此苷的性质也各有不同，导致中药复方中总苷含量的测定较困难[3]。现有的测定方法多着眼于苷元部分，先选定某一种或几种苷为代表，通过紫外分光光度法或色谱法检测，再与标准品比较，计算含量[4-5]。但此法存在以下不足：（1）仅以一种或少数几种苷类成分为代表，难以全面反映中药复方总苷的含量；（2）方法的普适性较差。有些苷类成分如人参皂苷的紫外响应较弱，在复方中存在其他苷类成分时用紫外分光光度法或液相色谱法难以同时检出[6]；（3）某些标准品价格高、不易得。因此，笔者以七味白术散为例，结合苷类化合物的结构特点，从苷的糖苷键及糖基着手，用酸解法使苷元与糖、糖与糖之间的糖苷键断裂，分离出苷元与还原糖，应用3,5-二硝基水杨酸法测定总苷酸解前后还原糖的含量，再以二者的差值表征七味白术散总苷的含量，期望为中药复方总苷的含量测定提供新思路、新方法。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验药材有土炒白术（浙江，批号2018062902）、人参（吉林，批号2018091891）、木香（云南，批号2018081401）、甘草（宁夏，批号2018102004）、广藿香（广东，批号2018041102）、葛根（湖南，批号2018080601）、茯苓（云南，批号2018121301），均购于湖南中医药大学附属第一医院。

主要试剂有3,5-二硝基水杨酸、苯酚、石油醚、正丁醇和葡萄糖标准品（国药集团化学试剂有限公司），氢氧化钠和四水合酒石酸钾钠（西陇科学股份有限公司，XK1320100153），无水亚硫酸钠和无水乙醇（天津市风船化学试剂科技有限公司，20190803）。乙酸乙酯和硫酸（湖南汇鸿试剂有限公司）。

主要仪器设备有UV1901PCS型紫外可见分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司）、KQ5200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、电子天平（Balance）、循环水式真空泵（上海雅荣生化设备仪器有限公司）、202-2AB型电热恒温干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）、都市主妇全能小钢磨（永康市铂欧五金制品有限公司）、HA-600三用恒温水箱（神科仪器厂）。

1.2 试验方法

1.2.1 七味白术散总苷的制备 将各饮片烘干打粉，过60目筛，按全方剂量的1/5（人参1.5 g、土炒白术3.0 g、茯苓3.0 g、葛根3.0 g、木香1.2 g、甘草0.6 g、藿香3.0 g）称取各味药粉末，加入10倍量沸水煎煮2次，每次30 min，将2次滤液合并，浓缩至40 mL；冷却后加入无水乙醇使乙醇的终浓度为75%，4℃醇沉过夜，将乙醇提取液浓缩至20 mL；用石油醚（10、5、5 mL）脱脂3次，水层依次用乙酸乙酯（15、10、10 mL）、水饱和的正丁醇（15、10、10 mL）各萃取3次；合并乙酸乙酯层及正丁醇层溶液，蒸干溶剂，即得七味白术散总苷。将所得的七味白术散总苷配成浓度为0.009 1 g/mL的样品溶液备用。

1.2.2 试剂制备 （1）DNS试剂制备：称取酒石酸钾钠45.5 g溶于250 mL水中，依次加入3,5-二硝基水杨酸1.625 0 g、NaOH 10.0 g，超声使其溶解；再加入苯酚1.25 g，无水Na2SO31.25 g，搅拌溶解；然后定容至500 mL，摇匀后储存在棕色瓶中，避光放置7 d后使用。（2）葡萄糖标准溶液制备：精确称取葡萄糖标准品0.5 g，加适量蒸馏水溶解后定容至500 mL，浓度为1 mg/mL。

1.2.3 检测条件的优化 取1 mL葡萄糖标准溶液，加入DNS试剂 5 mL，摇匀后沸水浴5 min，取出自然冷却后加蒸馏水定容至15 mL，摇匀后以蒸馏水为空白进行全波长扫描，得到最优检测波长。通过单因素试验分别考察DNS用量（1、2、3、4、5 mL）、显色时间（9、11、13、15、17 min）、显色温度（60、70、80、90、100℃）对含量测定的影响。

1.2.4 酸解条件的优化 取1 mL样品溶液，根据1.2.3得到优化的显色条件，通过单因素考察硫酸浓度（2、3、4、5、6 mol/L）、酸 解 温 度（60、70、80、90、100℃）、酸解时间（60、70、80、90、100 min）、料液比（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5）等酸解条件对总苷酸解的影响。

1.2.5 方法学考察 （1）精密度试验。取同一组1.2.1中总苷溶液1 mL按照优化后的条件，连续测定5次吸光度，分别考察检测方法及酸解方法的精密度。（2）重复性试验。取同一总苷溶液1 mL按照优化后的条件，测定5个样本的吸光度，考察检测方法及酸解方法的重复性。（3）稳定性试验。取1 mL总苷溶液按照优化后的条件测定吸光度，显色反应结束后检测0、30、60、90、120 min 的吸光度，考察检测方法及酸解方法的稳定性。（4）回收率试验。取同一总苷溶液1 mL，分别加入1 mL浓度分别为0.25、0.5、1.0 g/mL的葡萄糖标准溶液，按照优化后的检测方法对回收率进行考察。取同一总苷溶液1 mL分别加入1 mL浓度分别为0.3、0.4、0.5 g/mL的葡萄糖标准溶液，按照优化后的酸解方法对回收率进行考察。

2 结果与分析

2.1 检测条件的优化结果

2.1.1 最佳检测波长 通过全波长扫描，确定最大吸收波长为540 nm。

2.1.2 最优显色剂用量 由图1可知，总苷样品量为1 mL时，DNS用量在1～5 mL范围内，吸光度随着DNS用量的增加而增大，DNS用量为5 mL时吸光度到最大值，大于5 mL后吸光度基本没有变化。因此，确定DNS的最佳用量为5 mL。

图1 DNS用量对吸光度的影响

2.1.3 最优显色时间 先在3～17 min范围内以2 min为梯度进行检测，发现在3～13 min 内吸光度逐渐增加，没有到达峰值，故在9～17 min范围内再进行比较。由图2可知，显色时间在13 min时吸光度达到最大值，再延长显色时间吸光度逐渐下降。因此，确定最佳显色时间为13 min。

图2 显色时间对吸光度的影响

2.1.4 最优显色温度 由图3可知，温度在60～90℃范围内，吸光度随着温度的增加而增大，到达90℃后再增加温度，吸光度反而呈下降趋势。因此，确定最佳显色温度为90℃。

图3 显色温度对吸光度的影响

综合以上结果，DNS测定七味白术散总苷含量的最优条件为：检测波长540 nm，显色剂用量5 mL、显色时间13 min、显色温度90 ℃。

2.2 酸解条件的优化结果

2.2.1 最优硫酸浓度 酸解时硫酸浓度太高会碳化有机物，试验设定的考察范围为2～6 mol/L，结果如图4所示，酸浓度在3 mol/L时吸光度最大，当超过此酸度后吸光度呈现下降趋势，并且在高酸度条件下，试管中出现碳化现象。因此，确定试验最佳酸浓度为3 mol/L。

图4 酸浓度对吸光度的影响

2.2.2 最佳酸解温度 由图5可知，酸解温度在60～90℃时，吸光度随时间增加而增加，到达90℃后再增加温度，吸光度反而下降。因此，确定最佳酸解温度为90℃。

图5 酸解温度对吸光度的影响

2.2.3 最优酸解时间 酸解时间关系到酸解是否完全，时间太短酸解不完全。由图6可知，酸解80 min时吸光度最大。因此，最佳酸解时间为80 min。

图6 酸解时间对吸光度的影响

2.2.4 最优料液比 由图7可知，七味白术散总苷溶液与3 mol/L的硫酸的比例为1∶2时吸光度最大，料液比小于1∶2后吸光度逐渐减小。因此，最优七味白术散总苷溶液与3 mol/L的硫酸的比例为1∶2。

图7 料液比对吸光度的影响

综合以上结果，得到七味白术散总苷酸解的最优条件为：酸浓度3 mol/L、酸解温度90℃、酸解时间80 min，料液比1∶2。

2.3 方法学考察

2.3.1 检测条件方法学考察 由表1可知，检测条件精密度、重复性、稳定性试验的相对标准偏差（RSD）分别为0.45%、1.43%和1.04%，说明优化的DNS法稳定、可靠。由表2可知，样品的加标回收率在98.52%～101.78%之间，RSD分别为0.74%、0.16%、0.73%，说明该方法的回收性良好，准确度良好。

表1 检测条件的精密度、重复性、稳定性

表2 检测条件的加标回收率

2.3.2 酸解条件方法学考察 由表3可知，酸解条件的精密度、重复性、稳定性试验的相对标准偏差（RSD）分别为2.11%、0.38%、0.84%，说明优化的酸解方法稳定、可靠。由表4可知，样品的加标回收率在98.95%～101.23%之间，RSD分别为0.32%、0.79%、1.14%，说明该方法的回收性和准确度良好。

表3 酸解条件的精密度、重复性、稳定性

表4 酸解条件的加标回收率

3 结 论

苷类化合物的结构中包括了苷元、糖苷键及糖基部分，苷元的性质差异较大，而糖苷键酸解后得到的还原糖却容易检测[7]。由此推及，在酸解完全的情况下，所测得的总还原糖的量与苷的含量应呈正相关关系，考虑到中药复方总苷提取物可能含有还原糖的存在，故分别测定同一总苷溶液酸解前后的还原糖含量，以二者的差值表征总苷含量。基于此，该研究提出用酸解前后还原糖的差值代表中药复方总苷含量的思路，以七味白术散为例，选用DNS法测定其总苷含量。

七味白术散出自《小儿药证直诀》，由人参、白茯苓、炒白术、藿香、木香、甘草和葛根七味药组成[8]，内含人参皂苷、甘草酸、甘草苷、芒柄花苷、葛根素、大豆苷、染料木苷、金丝桃苷等苷类化合物[9]，主要为黄酮苷和皂苷，其中，葛根素为黄酮碳苷[10]。黄酮碳苷结构较稳定，需在强酸、高温或高压条件下酸解。若黄酮碳苷在某一条件下可酸解，其余的苷亦可在相同条件下顺利酸解。因此，该研究对七味白术散总苷的酸解条件进行考察，在特定条件下吸光度达到最大时视为酸解完全，得到最优酸解条件为：硫酸浓度3 mol/L、酸解温度90℃、酸解时间80 min、料液比1∶2。

蒽酮硫酸法及苯酚硫酸法虽可用于测定糖含量，但其酸解时间较短，难以将中药复方总苷酸解完全，故该研究选用DNS法进行测定。DNS法是常见的糖含量测定方法，主要用于测定还原性糖。其原理是还原性糖将3,5-二硝基水杨酸结构中的硝基还原为氨基，还原后的产物在碱性环境中呈现橘红色，可溶于碱性溶液。因此，可以用比色法测定还原性糖的含量[11]。该研究对DNS法测定七味白术散总苷的条件及方法学进行了考察，得到最优的检测条件为：检测波长540 nm，显色剂用量5 mL、显色时间13 min、显色温度90℃。该法的精密度、重复性、稳定性及回收率良好，且操作简单、反应迅速、无须贵重的仪器及标准品，适用于中药复方总苷的含量测定。