超声辅助酶法提取金银花多糖的工艺优化

吕 欣，谭春玲，麦名娜，林容芳,张美霞

（重庆文理学院林学与生命科学学院，重庆 402160）

金银花为忍冬科植物忍冬（Lonicera japonicaThunb）的干燥花蕾或初开的花，其药用历史悠久，是清热解毒、凉散风热的良药[1]，一般用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发热[2]和降血脂、降血糖[3]等。金银花多糖是金银花的主要活性成分之一[4]。近代研究表明，植物多糖具有抗肿瘤、降血糖、抗补体、抗氧化性[5-9]等生理活性，可应用于化妆品、保健品[10]等领域，具有一定的开发价值。常用的金银花多糖提取方法有水提法、超声提取法、水提醇沉法等，其多糖得率较低。周小楠等[11]采用酶法提取金银花多糖可显著提高多糖得率，赵鹏等[12]采用超声法提取金银花多糖，与传统水提法相比，超声提取时间可缩短2/3左右。目前，未见超声法与酶法联用提取金银花多糖的相关报道。因此，笔者以金银花为原材料，采用超声波辅助酶法提取金银花多糖，通过单因素试验及响应面分析法对多糖的提取工艺进行优化，探索超声辅助酶法提取金银花多糖的最佳工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试金银花来自康美药业股份有限公司。主要试剂有纤维素酶（10万U/g，和氏璧生物科技有限公司），葡萄糖、无水乙醇、丙酮、乙醚、苯酚（国药集团化学试剂有限公司），浓硫酸、盐酸（重庆川东化工有限公司）。主要仪器设备有752 紫外可见分光光度计（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）、XMTD-204 数显式电热恒温水浴锅（上海龙跃仪器设备有限公司）、SB-5200DTDN 超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）、电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械有限公司）、TGL-21 高速冷冻离心机（四川蜀科仪器有限公司）、DS-T300 高速多功能粉碎机（上海顶帅电器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 金银花多糖的提取方法 对周小楠等[11]提取方法进行改良。称取约10 g金银花粉末，按照要求的单因素条件进行超声提取，用8层纱布过滤，调节提取液pH值，酶解温度50℃，加入纤维素酶酶解1 h后100℃高温灭活10 min，4 000 r/min条件下离心20 min进行分离，弃去沉淀，用盐酸法[13]除蛋白，浓缩至原液体积的约1/10后加入4倍无水乙醇醇沉一夜，有絮状物析出，抽滤，滤饼依次用乙醇、丙酮、乙醚淋洗，干燥得金银花多糖。

1.2.2 金银花多糖含量的测定 （1）标准曲线的绘制。采用苯酚-硫酸法[14]测定多糖的含量。称取干燥至衡重的葡萄糖标准品0.1 g至100 mL容量瓶并用蒸馏水定容，制得1.0 mg/mL的葡萄糖标准溶液；取上述配制的葡萄糖标准液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL至100 mL容量瓶；定容至刻度，混匀，制得浓度分别0、20、40、60、80、100 μg/mL的葡萄糖标准溶液。从上述已配制各浓度葡萄糖标准液中分别取出2 mL于试管中，加入5%苯酚溶液1 mL，再迅速加入5 mL浓硫酸，摇匀，室温静置40 min，在490 nm下测定溶液的吸光度值。以葡萄糖浓度为横坐标（X），吸光度值为纵坐标（Y），绘制标准曲线。获得苯酚-硫酸法测定多糖浓度的标准曲线方程为：Y=0.007 3X-0.019 7，R2=0.992 7。（2）样品多糖含量的测定。按苯酚-硫酸法[14]称取0.01 g样品多糖于200 mL容量瓶中，定容至刻度，吸取2 mL溶液于试管中，加入5%苯酚溶液1 mL，再迅速加入5 mL浓硫酸，摇匀，室温静置40 min，在490 nm下测定溶液的吸光度值。多糖得率按下列公式计算。

式中，W为金银花多糖的得率（%）；C为从回归曲线中计算得出的糖浓度（mg/mL）；V为定容体积（mL）；M1为金银花粗多糖质量（mg）；M2为金银花原料质量（干花粉末，mg）；M3为配置金银花粗多糖溶液时称取的质量（mg）。

1.2.3 单因素试验 精确称取经粉碎过的金银花粉末10.0 g，参考周小楠等[11]及胡琴汉等[15]研究结果，设定酶解温度50 ℃、酶解时间为1 h固定不变，以超声时间60 min、超声温度50℃、超声功率200 W、料液比1∶20（g/mL）、酶添加量1.5%、酶解pH值5为试验常规量，分别考察超声时间（20、40、60、80、100 min）、超声温度（40、50、60、70、80℃）、超声功率（40、80、120、160、200 W）、料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL）、酶添加量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、酶解pH值（3、4、5、6、7、8）对金银花多糖得率的影响，每个处理设3次平行试验，从而确定上述6个因素的最佳参数。

1.2.4 响应面设计 结合单因素试验结果，采用Design-Expert 8.0.6软件进行Box-Behnken设计，分别选取酶用量（X1）、超声温度（X2）、料液比（X3）这3个对金银花多糖得率影响较为显著的因素为自变量，以金银花多糖得率为响应值（Y），进行三因素三水平[16-17]试验。试验设计因素及水平见表1。

表 1 响应面分析法的因素及水平

1.3 数据处理

试验数据采用SPSS 22.0软件进行单因素试验方差分析（方差同质性检验），用Excel 2010软件作图，采用Design-Expert 8.0.6软件对试验结果进行响应面优化，所有数据均重复测定3次，结果取平均值。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比对金银花多糖得率的影响 如图1所示，多糖得率随着料液比的增加而明显增高，这是因为随着水溶剂的增多，多糖可以充分溶出；在料液比为1∶50时，多糖得率最大；而料液比为1∶60时，多糖得率有下降趋势，这是由于水溶剂的增多，可能导致其他杂质溶出，导致溶出的多糖迅速在水中溶解[18]，且料液比过大可导致后期处理的损失增多，从而降低了多糖的得率。因此，确定最佳料液比为1∶50（g/mL）。

图1 不同料液比处理金银花多糖的得率

2.1.2 超声时间对金银花多糖得率的影响 如图2所示，随着超声时间的延长，多糖得率呈上升趋势，超声时间为60 min时，多糖得率最大，超过60 min后，多糖得率降低，可能是因为超声波具有较强的剪切作用[19]，时间过长会破坏多糖的分子结构[20]，促使多糖在外力作用下发生水解反应，从而降低多糖含量，影响得率。因此，确定最佳超声时间为60 min。

图2 不同超声时间处理金银花多糖的得率

2.1.3 超声温度对金银花多糖得率的影响 如图3所示，随着超声温度的升高，扩散作用随之增强，分子运动更加剧烈，多糖得率有升高的趋势，但超过50℃后，多糖得率出现了明显的下降，可能是由于高温和超声波破碎的协同作用导致部分金银花多糖的结构被破坏和降解[21]，且温度过高容易造成溶剂气化，不利于溶剂与物料的接触，从而影响多糖得率[22]。因此，确定最佳超声温度为50℃。

图3 不同超声温度处理金银花多糖的得率

2.1.4 超声功率对金银花多糖得率的影响 如图4所示，随着超声功率的增大，多糖得率呈上升趋势，超声功率为200 W时，多糖得率最高，但得率增加并不明显，说明该因素对多糖得率的影响不大。因此，确定最佳超声功率为200 W。

图4 不同超声功率处理金银花多糖的得率

2.1.5 酶解pH值对金银花多糖得率的影响 如图5所示，随着酶解pH值的增大，多糖得率先升高后下降，当酶解pH值为6时，多糖的率最高。这是因为酶解pH值主要作用于纤维素酶，而纤维素酶发挥酶活性的最适pH值为4.5～6.5，当提取液的pH值接近纤维素酶的最适pH值时，酶活性较大[23]。而多糖提取液的pH值为5，从简化试验的角度，确定最佳酶解pH值为5。

图5 不同酶解pH值处理金银花多糖的得率

2.1.6 酶用量对对金银花多糖得率的影响 如图6所示，随着酶用量的增加，多糖得率不断升高，是因为加入纤维素酶导致细胞壁破坏，进一步溶出多糖，且酶用量越多，酶与底物的反应越充分，酶用量超过2.5%，多糖得率有下降趋势，因为酶与底物已经充分反应[24]，多余的酶不与底物作用，还有可能导致多糖降解[25]，使杂质溶出。因此，确定最佳酶用量为2.5%。

图6 不同酶用量处理金银花多糖的得率

2.1.7 单因素显著性差异分析

由SPSS22.0软件单因素方差分析得出，料液比、超声时间、超声温度、超声功率、酶用量、酶解pH值对金银花多糖得率影响的P值分别为0.000、0.202、0.037、0.920、0.044、0.932；其中，料液比对多糖得率有极显著影响，超声温度、酶用量对多糖得率有显著影响，而超声时间、超声功率、酶解pH值对多糖得率的影响不显著。因此，选择料液比、超声温度、酶用量这3个因素进行Box-Behnken试验设计。

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面试验设计与结果 根据Box-Behnken试验设计原理，结合单因素试验结果，得出响应面方案与试验结果（表2）。

表2 响应面设计方案与试验结果

2.2.2 模型建立与显著性检验 用Design-Expert 8.0.6软件对表2数据进行回归拟合，得到回归拟合方程为：Y=55.12+1.84X1+0.53X2-2.51X3-0.27X1X2-2.49X1X3+0.58X2X3-8.47X12-2.49X22-9.93X32。其中，Y为多糖得率，X1为酶用量，X2为超声温度，X3为料液比。

从表3可以看出，模型P值为0.000 2＜0.01，是极显著的，且失拟项P=0.093 9＞0.05，不显著，R2=0.967 8，表明该模型拟合效果好[26]，试验误差较小，Radj2=0.926 4，表示有92%的响应值变化可以用该模型解释，同时也可以用该回归方程预测提取率与多糖得率的关系，可信度较高。从表3还可以得出，3个因素对多糖得率的影响由大到小排列依次为X3（料液比）＞X1（酶用量）＞X2（超声温度）；X1和X3及X1X3影响显著 （P＜0.05），X12、X32影响高度显著（P＜0.000 1），X2、X1X2、X2X3和X22影响不显著。

表3 方差分析结果

2.2.3 响应面图分析 曲面图和等高线的形状可直观反映出料液比、酶用量及超声温度3个因素对金银花多糖得率的影响。由图7可知，任何2个交互因素都存在最大响应值。由图7A可知，当料液比一定时，多糖得率随着酶用量的增加而呈现先增大后减小的趋势，随着超声温度的升高呈现平缓增大的趋势；从等高线形状可看出，酶用量和超声温度的交互作用对多糖得率影响不显著，同时可以得出，酶用量对多糖得率的影响大于超声温度。由图7B可知，当超声温度一定时，多糖得率随着酶用量的增大呈现先增大后减小的趋势，随着料液比的增大呈现先增大后减小的趋势；从等高线形状可看出，料液比和酶用量的交互作用对多糖得率的影响较显著，同时可得出，料液比对多糖得率的影响大于酶用量。由图7C可知，当酶用量一定时，多糖得率随着超声温度的升高而平缓增大，随着料液比的增大而呈现先增大后减小的趋势，等高线的形状可看出，料液比和超声温度的交互作用对多糖得率影响不显著，同时可以得出，料液比对多糖得率的影响大于超声温度。从图7还可以看出，图7B的3D响应曲面最为陡峭[27-29]，且等高线最为密集，其次为图7C。因此，可判断料液比与酶用量的交互作用对多糖得率的影响最大，其次为料液比与超声温度的交互作用的影响。综合来看，3个单因素对多糖得率影响的顺序表现为料液比＞酶用量＞超声温度，与方差分析表结果相符。

图7 不同因素交互作用对金银花多糖得率影响的响应面与等高线图

2.2.4 验证试验 通过Design-Expert 8.0.6软件分析，得出提取金银花多糖的最优工艺为：料液比1∶48（g/mL），超声温度50.83 ℃，酶用量2.56%，金银花多糖的得率预测值为55.432 7%。根据实际情况对工艺进行修正，修正后的试验条件为：料液比1∶48（g/mL），超声温度50.80 ℃，酶用量2.56%，在此条件下进行3次平行试验进行验证，得到的金银花多糖平均得率为54.275%，与回归模型预测的理论值相近，进一步说明该模型可靠。

3 结 论

采用超声法与酶法联用提取金银花多糖，相比传统的水提法，具有节约时间和提高多糖得率的优点。通过响应面优化法分析得出在料液比1∶48（g/mL），超声温度50.80 ℃，酶用量2.56%，超声时间60 min，超声功率200 W，酶解pH值为5的条件下，金银花多糖平均得率为54.274 9%。与已有文献相比，该方法大大提高了金银花多糖得率，可为金银花多糖的工厂化提取以及金银花多糖生物活性与化学结构的进一步研究奠定基础。