Galectin⁃9、NOX⁃1 mRNA在胆囊癌中表达变化及与癌细胞生物学行为指标的关系

彭正 陈之强 杨琦

作者单位：北京市顺义区医院普外一科，北京101300

胆囊癌是临床常见消化道系统恶性肿瘤，早期缺乏特异性临床表现，恶性程度高，具有早期诊断困难、根治性手术切除率低、预后较差等特点，据统计，其5年生存率不足5%［1］。研究表明，癌细胞侵袭性强、转移速度快是胆囊癌预后差、生存期短的主要因素［2］。胆囊癌发病机制较为复杂，目前临床普遍认为其发生发展过程涉及多种蛋白、基因，筛选出可靠标志物对早期诊断及预后改善具有重要意义。半乳糖凝集素9（Galactose lectin 9，Galectin⁃9）是一种抑癌基因，既往临床已发现其在胃癌、宫颈癌、食管鳞癌中均呈低表达，与病理进展密切相关［3］。NADPH 氧化酶1（NADPH oxidase 1，NOX1）是细胞内重要的氧化酶之一，在多种肿瘤发生与转移中发挥关键作用［4］。但关于两者在胆囊癌中的作用仍缺乏验证。为此，本研究分析Galectin⁃9、NOX⁃1 mRNA 在胆囊癌中表达变化及与癌细胞生物学行为指标的关系，旨在为临床提供数据支持。报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取本院2016年5月至2020年8月胆囊癌患者84 例作为研究对象，其中男40 例，女44 例，平均年龄（63.59±6.02）岁，肿瘤大小：平均（5.63±1.14）cm，临床分期：Ⅰ～Ⅱ期30 例，Ⅲ～Ⅳ期54 例，肿瘤浸润深度：Tis～T238 例，Ti3～T446 例，分化程度：高分化29 例，中分化23 例，低分化32 例，淋巴结转移40 例。选取距离癌组织边缘5 cm 左右的组织为癌旁正常组织。纳入标准：均经超声检查、病理检查证实为胆囊癌；手术切除前均未接受放化疗，预计生存期>6 个月。排除标准：合并其他恶性肿瘤者；存在胆道系统良性肿瘤者；伴有心肝肾等重要脏器严重功能异常者；临床资料缺失者。

1.2 方法

取胆囊癌患者手术切除的癌组织及距离癌组织边缘5 cm 左右的癌旁正常组织标本，采用Trizol法提取总RNA，于紫外分光光度计上定量分析RNA 纯度及浓度。采用日本TaKaRa 公司反转录试剂盒（PrimeScriptTMRT reagent Kitwith gDNA Eraser）将1 μg 总RNA 逆转录为cDNA，引物序列由上海杰李生物公司合成，反应条件为：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72℃2 min，40个循环，72℃延伸10 min，以2⁃△△CT值表示Galectin⁃9mRNA、NOX⁃1mRNA、癌细胞生物学行为指标［磷酸化信号转导与转录激活因子3（Phosphoryla⁃tion signal transduction and transcription activator 3，p⁃STAT3）、凋亡抑制基因Bcl⁃2、基质金属蛋白酶7（Matrix metalloproteinase 7，MMP⁃7）mRNA 相对表达量。

1.3 统计学方法

采用统计学软件SPSS 22.0 处理数据，计量资料以（）描述，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两组间比较采用LSD⁃t检验，两组间比较采用独立样本t检验；相关性分析采用Spear⁃man/Pearson 相关系数模型。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 癌组织与癌旁正常组织中Galectin⁃9、NOX⁃1 mRNA 相对表达量

癌组织中Galectin⁃9mRNA 相对表达量低于癌旁正常组织，NOX⁃1mRNA 相对表达量高于癌旁正常组织，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 癌组织与癌旁正常组织中Galectin⁃9、NOX⁃1 mRNA 相对表达量比较（±s）Table 1 Comparison of Galectin⁃9 and NOX⁃1 mRNA expression between cancer tissues and adjacent normal tissues（±s）

表1 癌组织与癌旁正常组织中Galectin⁃9、NOX⁃1 mRNA 相对表达量比较（±s）Table 1 Comparison of Galectin⁃9 and NOX⁃1 mRNA expression between cancer tissues and adjacent normal tissues（±s）

组别癌组织癌旁正常组织t 值P 值n 84 84 Galectin⁃9 mRNA 0.20±0.06 0.72±0.20 22.824<0.001 NOX⁃1 mRNA 2.78±0.41 1.03±0.22 34.471<0.001

2.2 癌组织中Galectin⁃9 mRNA 与NOX⁃1 mRNA关联性

Pearson相关性分析，癌组织中Galectin⁃9mRNA与NOX⁃1mRNA呈负相关（r=-0.688，P<0.001）。

2.3 癌组织中Galectin⁃9、NOX⁃1 mRNA 与临床病理特征的关系

Galectin⁃9mRNA 与年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤浸润深度无关（P>0.05），与临床分期、淋巴结转移、分化程度显著相关（P<0.05）。见表2。

表2 癌组织中Galectin⁃9、NOX⁃1 mRNA 与临床病理特征的关系Table 2 Relationship between Galectin⁃9、NOX⁃1 mRNA and clinicopathological features in carcinoma

2.5 癌组织中Galectin⁃9 mRNA 与癌细胞生物学行为指标相关性

以癌组织中Galectin⁃9mRNA 平均值为界分为低表达、高表达。Galectin⁃9mRNA 低表达癌组织中p⁃STAT3、Bcl⁃2、MMP⁃7mRNA 相对表达量高于高表达癌组织（P<0.05）。见表3。Pearson 相关性分析，Galectin⁃9mRNA 与p⁃STAT3、Bcl⁃2、MMP⁃7mRNA呈负相关（r=-0.619、-0.583、-0.657，P均<0.05）。

表3 癌组织中Galectin⁃9 mRNA 与癌细胞生物学行为指标相关性Table 3 Correlation between Galectin⁃9 mRNA and biological behavior of cancer cells

2.6 癌组织中NOX⁃1 mRNA 与癌细胞生物学行为指标相关性

以癌组织中NOX⁃1mRNA 平均值为界分为低表达、高表达。NOX⁃1mRNA 低表达癌组织中p⁃STAT3、Bcl⁃2、MMP⁃7mRNA 相对表达量低于高表达癌组织（P<0.05），见表4。相关性分析，NOX⁃1mRNA 与p⁃STAT3、Bcl⁃2、MMP⁃7mRNA 呈正相关（r=0.633、0.712、0.604，P均<0.05）。

表4 癌组织中NOX⁃1 mRNA 与癌细胞生物学行为指标相关性（±s）Table 4 Correlation between NOX⁃1 mRNA and biological behavior of cancer cells（±s）

表4 癌组织中NOX⁃1 mRNA 与癌细胞生物学行为指标相关性（±s）Table 4 Correlation between NOX⁃1 mRNA and biological behavior of cancer cells（±s）

组别低表达癌组织高表达癌组织t 值P 值n 31 53 p⁃STAT3 mRNA 14.11±2.36 17.18±3.07 4.796<0.001 Bcl⁃2 mRNA 0.61±0.11 0.88±0.22 6.372<0.001 MMP⁃7 mRNA 7.29±1.38 9.35±1.12 7.458<0.001

3 讨论

胆囊癌在所有胆道系统恶性肿瘤中约占41.30%，由于早期诊断困难，导致多数初诊患者已发展至进展期或晚期，其中61.50%～63.80%患者已发生转移，丧失根治性救治机会，且普遍预后较差［5⁃6］。因此，寻找分子标志物为临床早期诊断提供依据、为改善预后创造有利条件成为临床重要课题。

Galectin⁃9 是半乳凝集素家族中重要成员之一，既往研究表明，Galectin⁃9 可通过调控细胞功能参与炎症、免疫、肿瘤等疾病发生发展过程［7］。Enninga EA 等［8］报道中显示，Galectin⁃9 低表达能够加快黑色素瘤细胞增殖、迁移、侵袭，过表达能够加快黑色素细胞瘤细胞凋亡。本研究结果说明其可能通过下调表达促进胆囊癌发生，并加快病理改变及病情进展。结合陶桢等［9］研究考虑原因主要在于Galectin⁃9 具有抑制肿瘤作用，可通过特异性结合细胞表面、细胞间质中的半乳糖，传递细胞间、细胞与间质间的信号，从而对细胞黏附、聚集、分化、增殖、凋亡产生调控作用。当其低表达时，无法满足自身对肿瘤的抑制作用，导致肿瘤细胞加快增殖、分化，促进病理改变，不断加重病情程度［10］。本研究还显示，Galectin⁃9与p⁃STAT3、Bcl⁃2、MMP⁃7 mRNA呈负相关，可能是由于Galectin⁃9 抑癌作用与p⁃STAT3、Bcl⁃2、MMP⁃7促癌作用形成反向机制而致。由上述结果可知，以Galectin⁃9 为靶点，提高其在胆囊癌组织中的表达，可能会显著抑制胆囊癌淋巴结转移及组织分化，为临床改善预后提供新思路。

大量临床实践证实，氧化应激在肿瘤发生发展中具有重要作用［11⁃12］。NOX1 是诱导氧化应激反应的关键酶之一，能够增加细胞内活性氧（ROS）水平，参与肿瘤细胞外基质重构及细胞迁移、增殖等病理生理过程［13］。Yamamoto T 等［14］报道中显示，NOX1过表达会促使胃癌肿瘤细胞出现氧化应激反应，从而促使细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）含量增加，促进胃癌细胞增殖。本研究结果表明NOX1 可通过上调表达促进胆囊癌发生，并对病理改变产生加速作用。推测NOX1 过表达在胆囊癌中的作用机制为：NOX1上调后诱导胆囊癌组织内肿瘤细胞产生氧化应激反应，从而异常氧化蛋白质，使其丧失生物活性，并损伤DNA 双联链，引发DNA 双链畸变及碱基突变，进而激活原癌基因、抑制抑癌基因活性，导致正常细胞发生癌变；还可经由刺激肿瘤细胞增殖相关基因突变等途径加快肿瘤细胞变异，增强其恶性程度。p⁃STAT3、Bcl⁃2、MMP⁃7 是胆囊癌传统肿瘤增殖、侵袭基因，在胆囊癌发生发展中发挥重要作用［15⁃16］。本研究结果提示NOX⁃1 能与p⁃STAT3、Bcl⁃2、MMP⁃7等多项传统肿瘤增殖、侵袭基因发挥共同作用，促进胆囊癌病情进展。故临床可通过检测胆囊癌组织中NOX⁃1mRNA 相对表达量为评估病情、制定针对性抗肿瘤方案提供相关参考依据。

此外，本研究结果还显示，胆囊癌组织中Galectin⁃9mRNA 与NOX⁃1mRNA 具有负相关关系，可见两者在胆囊癌发生进展过程中联系紧密，联合检测能为临床提供更为可靠、全面的诊治依据，为后续治疗创造良好基础。本研究不足之处在于：作为小样本研究，可能造成数据偏移，需进一步采取多中心、大样本分析。

综上可知，Galectin⁃9mRNA 下调、NOX⁃1mRNA 上调可能是胆囊癌发生的重要机制，且两者表达水平与临床病理特征、癌细胞生物学行为指标密切相关，为临床诊治提供有效信息。