潮州市新生儿G6PD筛查和基因型鉴定分析

陈新瑶 梁雪雁 黄慧莹 林伟琦 丁燕佳 韦华贵 王俊利 林敏

作者单位：1.汕头大学医学院附属潮州市人民医院中心实验室，广东，潮州521011

2.右江民族医学院检验学院，广西，百色533000

3.韩山师范学院食品工程与生命科学院，广东，潮州521011

葡萄糖⁃6⁃磷酸脱氢酶（Glucose⁃6⁃phosphate dehydrogenase，G6PD）缺乏症俗称蚕豆病，是由于红细胞膜的G6PD 缺乏引起红细胞破坏并溶血的一种遗传性疾病［1］。G6PD基因位于染色体Xq28的片段，全长18.5 Kb，包含13 个外显子及12 个内含子。绝大多数的G6PD 缺乏症都是由于G6PD基因突变导致的，目前全球已经发现400 余种突变。G6PD 缺乏症是世界上最常见的红细胞遗传病之一，全球患病率约为5%，呈明显的地域性和种族性分布［2］，主要分布在东南亚、印度次大陆、中东地区及地中海沿岸和非洲地区。我国患病率在0.2%～44.8%之间，以两广、海南为高发区［3⁃5］。G6PD 缺乏症是新生儿病理性黄疸的主要发病因素，据文献报道，患G6PD 缺乏症的新生儿中约50%发生黄疸，其中12%会发展为核黄疸［6］，从而导致脑部损害，引起智力低下。为了解潮州地区人群G6PD 缺乏症分子流行病学特征，为本地区G6PD 缺乏症的防控提供依据，本研究总结了新生儿G6PD 活性筛查数据，并对部分样本进行基因型鉴定，结果汇总如下。

1 资料与方法

1.1 病例来源

选取2012年1月至2019年12月本院出生的34 813 份新生儿筛查样本，其中男性新生儿18 880例，女性新生儿15 933 例。本项目已获得本院伦理委员会批准，所有受试者监护人均签订知情同意书。

1.2 G6PD 活性筛查

根据《广东省新生儿疾病筛查管理办法》的标准［7］，严格按照操作规程，对出生72 h 以上的新生儿用里定血样标本采集卡采集足后跟血样制备血斑，自然干燥晾干后分别独立装进封口袋，送新生儿筛查实验室，并置2～8℃冰箱保存，一周内完成G6PD 活性筛查。剩余标本置-70℃低温保存箱保存，备分子生物学检测。根据《新生儿疾病筛查技术规范》［8］，采用广州巿丰华生物工程有限公司的葡萄糖⁃6⁃磷酸脱氢酶荧光分析试剂盒，严格按照操作说明进行G6PD 活性筛查。结果判定［9］：以G6PD 活性2.6 U/gHb 为界限，小于该值判为G6PD酶缺乏或减少，即为初筛阳性标本。

1.3 DNA 提取

从所有样本中随机抽取酶学缺乏的420 份男性样本进行分子生物学研究。实验过程如下：用欧歌重型打孔钳打下直径3 mm 的纸片各3 个，采用天根生物干血斑提取试剂盒制备DNA，DNA 质量由美国芬兰1510⁃05665 全波长酶标仪进行评价，在260～280 nm 的波长测定，并将其调整到10 ng/μL，保存于海尔DW⁃86L486 医用低温（-70℃）保存箱中。

1.4 基因型鉴定

上述DNA 采用广东凯普生物有限公司生产的葡萄糖⁃6⁃磷酸脱氢酶基因检测试剂盒（PCR⁃导流杂交法），可检测中国人群常见的14 种G6PD基因突变类型：c.95A>G、c.392G>T、c.487G>A、c.493A>G、c.592C>T、c.871G>A、c.1004C>T、c.1024C>T、c.1311C>T、c.1360C>T、c.1376G>T、c.1381G>A、c.1387C>T、c.1388G>A。严格按照试剂说明进行操作及判读。

1.5 统计分析

采用SPSS 20.0 软件进行统计分析。计数资料采用n（%）表示，行χ2检验；采用χ2检验检测基因频率是否符合Hardy⁃Weinberg 平衡定律，P>0.05为群体基因符合遗传平衡法则，样本数据来自同一孟德尔群体。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 潮州地区G6PD缺乏症酶学筛查与性别的关系

34 813份新生儿筛查样本中共筛查出G6PD缺乏样本1 167份，总阳性率为3.35%，男性检出率（4.75%）明显高于女性（1.69%），差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2 潮州地区G6PD 缺乏症突变谱

420 例男性酶缺乏标本中，检出9 种G6PD突变等位基因的样本占86.90%（365/420），其中最常见的5 种为c.1376 G>T、c.1388 G>A、c.95 A>G、c.1024C>T 和c.1311C>T。所有的c.871 G>A 均与c.1311C>T 连锁。见表1、图1。

表1 潮州地区420 例男性新生儿G6PD 缺乏症基因突变型别Table 1 Genotypes of G6PD deficiency in 420 male newborns in Chaozhou area

图1 G6PD 斑点杂交图谱Figure 1 Dot blot hybridization result of G6PD

2.3 G6PD 基因突变谱与酶活性的关系

分析上述男性新生儿G6PD活性与基因型的关系（c.487 G>A 样本太少，剔除），发现未检出突变的男性新生儿酶活性明显高于检出突变的样本，差异有统计学意义（P<0.05）。携带c.871G>A 连锁c.1311C>T 突变的样本酶活性明显低于单一突变样本，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2。

图2 基因突变谱与酶活性的关系Figure 2 Relationship between gene mutation profile and enzyme activity

3 讨论

我国是G6PD 缺乏症的高发区，研究表明，我国G6PD 缺乏症的发生率与纬度呈现反相关：随着纬度的升高/北移，G6PD 缺乏症的发生率下降，呈现“南高北低”的分布特点［3，10］。文献报道，我国北纬30°以北（长江以北）为低疟疾区，北纬25°至32°为中疟疾区，北纬25°以南为高疟疾区［11］。本研究潮州地区地处高疟区与中疟区的交界处，研究结果表明G6PD 缺乏症的发生率明显低于更低纬度（高疟区）的崇左、惠州［3，12］，但高于位于中疟区的地区如福州、温州［13⁃14］，与此前报道的关于我国G6PD 缺乏症的分布地域特点“疟疾正向选择假说”相一致［11］。

G6PD 缺乏症为X 连锁不完全显性遗传病，在男性群体中只存在正常或显著缺乏的两种半合子人群。因而，男性只要携带G6PD突变基因就会发病且表现为G6PD 重度缺乏。女性有2 条X染色体，X 染色体随机失活在女性群体中只有纯合子以及部分携带突变的杂合子表现出不同程度的酶缺乏。本研究中男、女G6PD 缺乏症发生率分别为4.75%和1.69%，符合X 染色体连锁不完全显性遗传的规律。迄今为止，全球共报道G6PD基因突变类型约220 多种［15］，其中在我国人群中发现33 种突变，最常见突变类型为c.1388G>A、c.1376G>T 和c.95A>G［11］。本研究结果与相关文献报道的中国人最常见的3 种G6PD基因类型相符［16］。有报道曾指出国内人群中的c.1311C>T 基因型常复合其他突变类型，发生率在5.1%～24%［17］。本研究中c.1311C>T 基因型的发生频率为4.76%，其中3.33%以复合形式出现，与之前的研究结果相一致［17⁃18］。值得关注的是，复合突变的标本G6PD 活性均明显低于单一突变的标本，这与有关文献指出复合突变可降低G6PD 活性的报道一致［18］。

综上所述，潮州地区新生儿G6PD 缺乏症发生率与本地区前期文献［19］研究数据对比有明显上升趋势，本研究小组推测几个可能原因：各地区人群交流日益频繁而使本地区人口结构不断变化；本次研究样本数量及时间跨度大，更能客观反映潮州地区新生儿G6PD 缺乏症发生率的情况。

G6PD 缺乏症目前尚无根治办法，仅能依据病情进行对症处理。因此，对新生儿进行G6PD 活性筛查并且加快普及基因突变检测，既能精准发现突变位点，又可避免发生漏诊的情况。随着分子生物学诊断技术的发展以及成本的降低，基因检测有望成为潮州地区G6PD 普查的一种新方法，从而积极而且有效地预防和控制诱因，对患儿早期治疗具有积极意义。