种植不同油茶品系实生苗对红壤胞外酶活性的影响

狄 岚，王小东，周莉荫，颜 聪，肖相元

（江西省林业科学院，江西 南昌 330013）

土壤胞外酶是由植物和微生物分泌的具有催化作用的蛋白质，在催化土壤有机质的分解、转化与矿化过程中和促进土壤养分的循环及固定方面均扮演着重要角色[1]，其对外界环境的变化能够敏感地作出反应。另外，土壤胞外酶是通过对碳（C）、氮（N）和磷（P）同化分解而可作为土壤营养缺乏和微生物营养需求的指标，这些酶被许多学者所关注[2]。经常测量的胞外酶主要有如下几类：土壤微生物分泌碳水解酶，主要包括β-1,4-葡糖苷酶（β-1,4-glucosidase，BG）、β-1,4-木糖苷酶（β-1,4-xylosidase，BX）和纤维二糖水解酶（Cellobioside，CB）等；氮水解酶，主要包括β-乙酰葡糖胺糖苷酶（β-N-acetylglucosaminidase，NAG）、亮氨酸氨基肽酶（Leucine aminopeptidase，LAP）等；磷水解酶，主要包括磷酸单酯酶（Acid phosphatase，AP）[3]。这些胞外酶的活性与土壤养分含量均密切相关。有关研究结果表明，土壤酶活性与土壤养分含量间呈显著正相关[4]，NAG 酶活性随着无机氮含量的增加而提高[5]，有效磷与AP 酶活性间存在显著正相关关系[6]。另外，种植不同品种植物也会影响土壤酶活性，如种植不同大麻品种对土壤酶活性的影响程度并不一致[7]，宁夏引黄灌区位于黄河上游的下河沿和石嘴山两个水文站之间，沿黄河两岸地形呈“J”字形带状分布状，其苜蓿品种对土壤酶活性的影响程度也因品种的响应程度而有差异[8]。因此，不同植物品种对土壤酶活性的影响问题仍然值得深入研究。

油茶Camellia oleiferaAbel.属山茶属Camellia山茶科Theaceae 植物，为常绿小乔木或灌木，是我国特有的木本食用油料树种，是世界四大木本油料植物之一[9]。油茶主要生长在我国南方亚热带区丘陵地带，具有较高的经济价值，也具有较强的生态功能。野生油茶的营养生长期较长（一般为3～5 a），而其种子的平均产量低，针对野生油茶的缺点，有关研究者对油茶进行了人工栽培和育种等方面的研究[10]。然而，他们主要从叶光合[11]、产果量[12]、产油率[13]等方面进行比较，对其土壤的比较，无非就是比较水肥管理[14]的差异，而针对油茶品系对土壤环境尤其是根际土壤环境造成的影响问题的研究报道却甚少。前期的研究大多关注外在养分胁迫对植物生长的影响问题[15]，而关于不同油茶品系种植土壤酶活性差异的研究报道却较少。为了解野生油茶与人工栽培种油茶品种对其根际土壤的影响情况，以红壤为基质，研究了盆栽野生油茶、栽培种赣油1 号和赣永6 号油茶实生苗对土壤酶活性的影响情况，以期为酸性红壤土中油茶品种的选育与栽培提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料与试验设计

野生油茶C.oleifera种子采集于江西省井冈山（26°33′N，114°07′E）；栽培种油茶（赣油1 号C.oleiferacv.Ganyou No.1 和赣永6 号C.oleiferacv.Ganyong No.6）种子均采自江西省永丰县的油茶园（26°53′N，115°38′E）。将采集的种子带回实验室后埋于沙中（相对湿度保持为5%）过冬。次年3月5日将过冬的种子置于含沙的塑料盘中萌发（相对湿度保持为25%）。4月2日将上述生长一致的油茶幼苗移栽至图1所示的实验装置中，每个装置中各种2 棵幼苗，装置中纤维素滤膜的孔径为30 μm，装置左右两边均为红壤，中间为石英砂（用10%的稀释HCl 浸泡1 d 后洗净）。每个处理各设30 次重复。移栽90 d 后，随机选取5 个重复，收集其根际土壤（以距离根1 mm 以内的土壤为根际土），并将其分为两份，一份于4 ℃下保存以用于土壤有效氮含量和酶活性的测定；另一份自然风干后用于全量养分含量的测定。

图1 植物培养装置Fig.1 Plant culture device

供试的土壤样品取自于江西省林业科学院（28°44′N，115°48′E），为典型的红壤土，其pH 值为4.75，其有机质含量为3.45 g·kg-1，铵态氮含量为17.88 mg·kg-1，硝态氮含量为97.78 mg·kg-1，全磷含量为0.16 g·kg-1，速效磷含量为7.22 mg·kg-1，速效钾含量为36.23 mg·kg-1。每个装置中栽培土的用量和种植管理措施均一致。

1.2 土壤理化性质的测定

用pH 计测定土壤pH 值（土∶水=1.0∶2.5）；用高锰酸钾-硫酸亚铁滴定法测定有机碳（Soil organic carbon，SOC）含量；采用HClO4-H2SO4消煮法，以连续流动分析仪测定全磷（Total phosphorus，TP）含量。铵态氮（NH4+-N）和硝态氮（NO3--N）含量的测定方法，即以2 mol·L-1的KCl 为浸提液（土∶液=1∶10），于180 r·min-1的振荡器上振荡2 h；有效磷（Olsen-P）含量的测定方法为，将0.03 mol·L-1的氟化铵和-0.025 mol·L-1的盐酸浸提液（土∶液=1∶10）置于振荡器上振荡5 min，再将这些浸提液静置后采用连续流动分析仪进行测定；以2 mol·L-1的醋酸铵为浸提液，用火焰光度计直接测定速效钾含量[16]。

1.3 土壤酶活性的测定

采用土壤酶试剂盒（中国苏州市科敏生物技术有限公司）测定土壤碳（C）、氮（N）和磷（P）转化过程中起关键作用的6 种酶的活性，所测土壤6 种酶的详细信息见表1。采用双抗体夹心法[17]测定样本中β-1,4-葡糖苷酶（β-1,4-glucosidase，BG）、β-1,4-木糖苷酶（β-1,4-xylosidase，BX）、纤维二糖水解酶（Cellobioside，CB）、亮氨酸氨基肽酶（Leucine aminopeptidase，LAP）、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（β-N-acetyl-glucosaminidase，NAG）、酸性磷酸酶（Acid phosphatase，AP）的活性。具体操作步骤如下：酶标板上的标准品为50 μL，从待测样品孔中加入稀释5 倍后的样品稀释液；然后每孔各加入酶标试剂50 μL，空白孔除外；接着每孔各先后加入显色剂A 50 μL 和显色剂B 50 μL，轻轻振荡混匀，于37 ℃的避光条件下显色10 min；最后每孔各加入50 μL 的终止液，使蓝色立转黄色；最后在15 min 之内于450 nm 的波长下依序测量各孔的吸光度（OD 值）[18]。

表1 所测土壤酶的名称、编码、类别和功能Table 1 The names,codes,classifications and functions of the tested soil enzymes

1.4 数据分析

利用SPSS 19.0 软件分析所种的野生油茶和栽培种油茶品系（赣油1 号及赣永6 号）实生苗对土壤酶活性及土壤理化性质的影响差异情况，使用单因素方差分析法确定了3 种油茶品系对土壤酶活性影响的差异显著性水平（P＜0.05）；利用Origin 2018 软件作图。

2 结果与分析

2.1 种植不同品系油茶实生苗对土壤理化特性的影响

种植不同油茶品系实生苗对土壤理化特性的影响情况见表2。由表2可知，与本底值（为种植油茶之前土壤理化指标的测定值）相比，种植油茶有助于土壤酸碱度、有机碳、全磷、有效磷和速效钾含量的增加，却能使其有效氮（铵态氮和硝态氮）含量显著降低。种植野生油茶和赣油1 号、赣永6 号油茶对土壤性质的影响情况不同。种植赣油1 号和赣永6 号油茶的土壤有机碳、全磷和有效磷含量均显著高于种植野生油茶的土壤相同养分含量，但2 个栽培种和野生种之间均无差异。种植赣永6 号油茶的土壤硝态氮含量显著高于种植野生油茶和赣油1 号的土壤硝态氮含量，其增幅分别为20.05%和19.87%；而种植野生油茶和赣油1 号油茶的土壤铵态氮含量均显著高于种植赣永6 号油茶的土壤铵态氮含量，其增幅分别为125.79%和144.65%。种植赣永6 号油茶的土壤速效钾含量显著高于种植野生油茶的，高出20.62%。但是，种植野生油茶、赣油1 号油茶、赣永6 号油茶的土壤酸碱度无明显差异。

表2 种植不同品系油茶实生苗对土壤理化特性的影响情况†Table 2 Effects of planting different varieties of C.oleifera on soil physical and chemical properties

2.2 种植不同品系油茶实生苗对土壤酶活性的影响

2.2.1 种植不同品系油茶实生苗对土壤碳水解酶活性的影响

种植不同品系油茶实生苗对土壤碳水解酶活性的影响情况如图2所示。由图2可知，赣永6 号油茶种植土壤的β-1,4-葡糖苷酶活性显著高于野生油茶和赣油1 号油茶种植土壤的β-1,4-葡糖苷酶活性，其增幅分别为18.76%和19.34%；赣油1 号油茶种植土壤的β-1,4-木糖苷酶活性最高，比野生油茶和赣永6 号油茶种植土壤的β-1,4-木糖苷酶活性分别高出42.26%与39.28%；野生油茶种植土壤的纤维二糖水解酶活性最高，比赣油1 号和赣永6 号油茶种植土壤的纤维二糖水解酶活性分别高出34.70%与37.23%。

图2 种植不同品系油茶幼苗对土壤碳水解酶活性的影响Fig.2 The effect of planting different Camellia varieties on the activity of soil carbon hydrolase

2.2.2 种植不同品系油茶实生苗对土壤氮水解酶活性的影响

种植不同品系油茶实生苗对土壤氮水解酶活性的影响情况如图3所示。由图3可知，赣永6 号油茶种植土壤的亮氨酸氨基肽酶活性显著高于野生油茶和赣油1 号油茶种植土壤的亮氨酸氨基肽酶活性，比野生油茶和赣油1 号油茶种植土壤的亮氨酸氨基肽酶活性分别高出9.45%与14.34%；赣永6 号油茶种植土壤的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性最高，野生油茶种植土壤的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性次之，赣油1 号油茶种植土壤的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性最低。另外，赣永6 号油茶种植土壤的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性显著高于野生油茶和赣油1 号油茶种植土壤的酶活性，其增幅分别为8.57%和10.93%，而野生油茶和赣油1 号油茶种植土壤的亮氨酸氨基肽酶和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性之间的差异均不明显。

图3 种植不同品系油茶幼苗对土壤氮水解酶活性的影响Fig.3 The effect of planting different varieties of C.oleifera on soil nitrogen hydrolase activity

2.2.3 种植不同品系油茶实生苗对土壤磷水解酶活性的影响

种植不同品系油茶实生苗对土壤磷水解酶活性的影响情况如图4所示。由图4可知，野生油茶种植土壤的酸性磷酸酶活性显著低于赣油1 号和赣永6 号油茶种植土壤的酸性磷酸酶活性，其降幅分别为20.88%与13.91%；而栽培种赣油1 号与赣永6 号油茶种植土壤的酸性磷酸酶活性之间却无差异。

图4 种植不同品系油茶幼苗对土壤磷水解酶活性的影响Fig.4 The effect of planting different varieties of C.oleifera on soil hydrolase activity

3 结论与讨论

3.1 种植不同品系油茶实生苗对碳水解酶的影响

土壤酶是催化碳、氮、磷等养分循环的生物蛋白催化剂，其活性能够反映土壤肥力及土壤环境质量状况[19]。纤维素是土壤碳的主要来源物之一，β-1,4-葡糖苷酶、β-1,4-木糖苷酶和纤维二糖水解酶与纤维素的分解均密切相关[20]。研究结果表明，种植不同品系油茶实生苗对土壤有机碳矿化过程中起关键作用的3 种碳水解酶活性的影响程度不同，表明不同品系油茶实生苗应对资源碳获取的调控方式不同，也就是说，植物对土壤的活性碳和难降解碳的获取方式不同。研究中发现，野生油茶种植土壤碳水解酶中纤维二糖水解酶的活性显著弱于栽培种赣油1 号和赣永6 号油茶种植土壤纤维二糖水解酶的活性，说明栽培种赣油1 号和赣永6 号油茶的根系向土壤中输入的碳物质较多。另外，种植野生油茶的土壤中β-1,4-葡糖苷酶和β-1,4-木糖苷酶的活性均显著弱于栽培种赣油1 号和赣永6 号油茶种植土壤的两种酶活性，这可能是由于种植野生油茶会减少来源于根系的有机质的输入，降低微生物活性，从而导致酶活性减弱[21]。有关研究结果表明，碳水解酶活性降低主要是由底物数量和质量的变化引起的[22-23]。值得注意的是，纤维二糖水解酶活性在野生油茶种植土壤中表现出最高值，比赣油1 号和赣永6 号油茶种植土壤的纤维二糖水解酶活性分别高出34.70%与37.23%，这一结果说明，由于功能不同的酶其作用的底物不同，种植的油茶苗其品系不同，其影响土壤碳水解酶活性的机制可能不同，β-1,4-葡糖苷酶和β-1,4-木糖苷酶主要分解结构简单的碳化合物，而纤维二糖水解酶主要分解较难分解的碳物质，由此可以推测，种植野生油茶能使土壤中结构简单的碳物质减少，而种植赣油1 号和赣永6 号油茶幼苗则有利于积累土壤中结构简单的碳物质。这可能因为，之前的野生油茶种子是在生境贫瘠的土壤中采集的，对于土壤碳获取酶的投入可能倾向于分解较难物质的酶（纤维二糖水解酶），因而种植野生油茶幼苗能使土壤纤维二糖水解酶保持高活性，而β-1,4-葡糖苷酶与β-1,4-木糖苷酶活性均处于较低水平。种植栽培种赣油1 号与赣永6 号油茶幼苗提高了土壤中有机质的积累量，满足了微生物的营养需求，进而促使了酶的合成[24-25]，因此，赣油1 号种植土壤的β-1,4-葡糖苷酶活性与赣永6 号油茶种植土壤的β-1,4-木糖苷酶活性均有所增强。另外，种植不同品系油茶幼苗的土壤碳水解酶中纤维二糖水解酶活性的测定值为60～80 IU·g-1，而其β-1,4-葡糖苷酶和β-1,4-木糖苷酶活性均显著低于纤维二糖水解酶活性，说明土壤中的纤维素含量最高，半纤维素含量次之，纤维素二糖含量最低。

3.2 种植不同品系油茶实生苗对氮水解酶的影响

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶可降解土壤腐殖质中的几丁质和肽聚糖，亮氨酸氨基肽酶可水解蛋白质和氨基酸，因此，土壤氮水解酶（N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶和亮氨酸氨基肽酶）是参与土壤氮循环的重要角色[26]。研究中发现，赣永6 号油茶种植土壤中亮氨酸氨基肽酶和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的活性均最高，另外，种植赣永6 号油茶的土壤硝态氮含量显著高于种植野生油茶和赣油1 号的土壤硝态氮含量，但种植赣永6 号油茶的土壤铵态氮含量显著低于种植野生油茶和赣油1 号的土壤铵态氮含量，说明赣永6 号油茶种植土壤的亮氨酸氨基肽酶和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性更有利于土壤的硝化，降低土壤的氨化作用。土壤酶活性与土壤微生物的活性是密不可分的，赣永6 号油茶根系分泌物刺激了土壤微生物活性，促进了由微生物分泌出的亮氨酸氨基肽酶和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶对几丁质和肽聚糖的分解[27]。另外，有关研究结果表明，土壤酶是富含氮的化合物，其受到土壤氮有效性的严格调控[28]。研究中发现，种植野生油茶和赣油1 号油茶能使土壤中有效氮含量（即硝态氮和铵态氮的总量）降低，而且其种植土壤中氮水解酶（N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶和亮氨酸氨基肽酶）的活性显著低于赣永6 号油茶种植土壤中氮水解酶的活性，这可能因为，种植的野生油茶和赣油1 号油茶其根系分泌物较少，不足以刺激微生物产生出足够多的亮氨酸氨基肽酶和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶。

3.3 种植不同品系油茶实生苗对磷水解酶的影响

磷酸酶能促进各种有机磷化合物的分解，为植物生长提供有效磷素[29-30]。试验结果表明，种植赣油1 号和赣永6 号油茶实生苗的土壤全磷和有效磷含量均显著高于野生油茶种植土壤的，而赣油1 号和赣永6 号油茶实生苗种植土壤的全磷和有效磷含量无差异。而且，种植赣油1 号和赣永6 号油茶的根际土壤酸性磷酸酶活性均受到明显的刺激作用，说明种植的赣油1 号和赣永6 号油茶根系会促进微生物对土壤磷养分的有效转化。有关研究结果表明，土壤全磷含量与磷酸酶活性之间存在显著的正相关关系[31]。试验结果也表明，赣油1 号和赣永6 号油茶的种植土壤其酸性磷酸酶活性因全磷含量的增加而提高，最终使其有效磷含量增加。本研究结论主要是在分析盆栽试验结果的基础上得出的，不同品系油茶对土壤各养分和酶活性指标的具体影响情况还需结合大田试验进行深入的研究。此外，本研究选在幼苗移栽90 d 后才取样的原因是：试验过程中，3月初对油茶种子进行萌发，4月初将幼苗转移到种植装置之中。油茶的营养生长速率一般在7月达到高峰，之后由于高温，其生长变缓，而本研究移栽的是实生幼苗，3 个月的生产期，可以反映其生长对土壤胞外酶的影响情况。有关研究结果表明，植物的根际养分与其根系功能性状间存在一定的相关性[32]。因此，接下来的研究可结合油茶根系性状特征分析其根际养分特性，深入探讨根系性状与根际土壤养分含量的关系及其变化规律，从而为油茶幼苗的培育生产提供理论依据与实践指导。

综上所述，种植3 个品系油茶实生苗对土壤酶活性的影响情况因酶的种类不同而不同。种植野生油茶实生苗能使土壤养分（有机碳、全磷、有效磷和速效钾）含量显著低于栽培种赣油1 号和赣永6 号油茶种植土壤的各养分含量，而其纤维二糖水解酶活性显著高于两个栽培种种植土壤的。种植野生油茶的土壤纤维二糖水解酶活性最高，而其β-1,4-葡糖苷酶和β-1,4-木糖苷酶活性均显著低于栽培种赣油1 号和赣永6 号种植土壤的。种植赣永6 号实生苗的土壤铵态氮含量最低，而其硝态氮含量最高，且种植赣永6 号的土壤氮水解酶（亮氨酸氨基肽酶和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶）活性显著高于野生油茶和赣油1 号油茶种植土壤的氮水解酶活性，说明种植赣永6 号油茶的土壤亮氨酸氨基肽酶和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性更有利于土壤的硝化，能降低土壤的氨化作用。种植赣油1 号和赣永6 号油茶的土壤酸性磷酸酶活性因其全磷含量的增加而提高，最终使其有效磷含量有所增加。因此，与野生油茶相比，种植赣永6 号油茶能更加显著地提高土壤全量养分和有效养分的含量，说明种植赣永6 号油茶有利于土壤地力的改善，与赣油1 号相比，赣永6 号油茶种植土壤的氮水解酶（亮氨酸氨基肽酶和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶）活性强于赣油1 号种植土壤的氮水解酶活性，这一结果说明，对氮素的需求量，赣永6 号高于赣油1 号，这对种植土壤养分的变化也产生了一定程度的影响。可见，种植栽培种赣油1 号和赣永6 号油茶对土壤的影响强度高于种植野生油茶，其中，种植赣永6 号油茶对土壤地力的影响强度最大，该结果可为油茶在酸性红壤中的选育栽培提供一定的理论依据。