油茶饼粕固态发酵后养分变化

张 晖，吴雪辉，董 斌，黄永芳

（1.仲恺农业工程学院，广东 广州 510225；2.华南农业大学 a.食品学院；b.广东省森林植物种质创新与利用重点实验室，广东 广州 510642；3.广东农工商职业技术学院，广东 广州 510507；

油茶Camellia oleifera自2016年正式被国家列为大宗油料作物，油茶产量逐年增加，在种植面积、产油量、产值上均稳步提高。在南方很多产区油茶产业很快成为加快农村经济调整的特色产业，是扶贫攻坚和乡村振兴的支柱产业[1]。

近年来油茶的研究热点主要集中在茶油抗氧化活性、皂素提升价值等方面[2]。茶粕中的茶皂素（占10%～14%）具备抗菌消炎、抗高血压、抗渗透和抑制酒精吸收等生物活性[3-4]。鉴于饲用的前提是茶皂素去除，过去有关油茶饼粕的饲用研究，一般首先通过微生物或物理化学的方法去除茶皂素[5]，然后才能进一步作饲用[6]。同时，针对油茶饼粕中多糖[7]和糖萜素[8]物质也有相关的提取工艺及应用研究。目前，我国每年产生的油茶籽在100 万t 左右，剩余残留的油茶籽粕产量为70 万t/年[9]。如何有效利用油茶饼粕，特别是对除去了茶皂素后的油茶饼粕如何能够更好的发挥其价值，开展一个绿色生态环保的新方向成为当前解决饼粕去向的研究热点。油茶饼粕固态发酵用作有机肥的深度研究相对不多，常规做法是通过自然发酵处理。本研究基于前期利用哈茨木霉（Trichoderma harzianum）、黑曲霉（Aspergillus niger）、鲁氏毛霉（Mucor roxianus）于不同环境温度和油茶饼粕含水量下进行固态发酵研究；进一步分析固态发酵后油茶饼粕中养分变化情况，为油茶饼粕固态发酵作有机肥提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源

本实验采用的菌种包括3 种霉，分别为哈茨木霉（Trichoderma harzianum）（简称木霉）、黑曲霉（Aspergillus niger）、鲁氏毛霉（Mucor roxianus）（简称毛霉），均购于广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心，为冻干菌种。

1.1.2 油茶饼粕

实验用的油茶饼粕购于广东新大地生物科技有限公司，是未脱茶皂素的饼粕。

1.2 培养基配制

培养基为综合马玲薯培养基，1 L 培养基中含20% Potato extract（马玲薯汁），KH2PO43 g，Vitanib B1（硫胺素）Trace 8 mg，Glucose（葡萄糖）20 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，pH=6。

1.3 油茶饼粕去茶皂素处理

通过水提法脱去茶皂素的油茶饼粕。水提法是将油茶饼粕浸泡在pH=10，固液比1∶10 的80 ℃热水中，12 h 后进行脱水，60 ℃烘干备用[10]。

已脱茶皂素油茶饼粕（简称油茶饼粕，下同）养分检测[11]项的有效氮、有效磷、有效钾结果如表1所示。

表1 已脱茶皂素油茶饼粕养分Table 1 Nutrients of non-saponinoil-teacake (Camellia) mg·kg-1

1.4 油茶饼粕发酵设置

油茶饼粕分装到组培瓶中，每个组培瓶装30.0 g材料，105 ℃下灭菌4 h（对照不作灭菌处理）。灭菌后加入无菌水以调节油茶饼粕含水量（40%、50%、60%、70%），分别接入菌体2 ml（105cfu/ml）于油茶饼粕中，将材料置于温度设置20 ℃、30 ℃、40 ℃的人工气候箱中，定期观察菌体生长情况及油茶饼粕变化，每个处理3 个重复。

试验分对照和添加菌种（毛霉、木霉和黑曲霉）处理，设置3 个温度区间20 ℃、30 ℃、40 ℃，以及4 个含水量（40%、50%、60%、70%），试验进行完全组合。

2 结果与分析

3.4 不同菌种在已脱茶皂素的茶粕发酵后主要养分变化情况

3.4.1 油茶饼粕发酵后有效氮变化

本试验进行过程中，虽然油茶饼粕是置于封盖的组培瓶中进行，但是由于在40 ℃时，水分仍然可以从瓶中蒸发导致油茶饼粕变干，菌种无法在油茶饼粕中正常生长，使得该温度下的菌体无法正常生长，而如果在试验过程中添加水分，将会导致试验中的茶粕含水量无法达到各处理要求，所以本试验结果不包括40 ℃的处理，此条件下可认为不适宜本方法的固态发酵。

油茶饼粕在对照以及接种毛霉、木霉和黑曲霉发酵后有效氮含量如表2所示，发酵后的有效氮含量较发酵前要高，但对照处理在20 ℃、含水量70%条件下的有效氮含量损失最多，只有821.1 mg/kg，比发酵前有效氮含量降低了29.28%。油茶饼粕在接种黑曲霉，在20 ℃、含水量60%条件下，其有效氮含量达到1 596.0 mg/kg，比发酵前油茶饼粕有效氮含量提高了74.31%，是20 ℃所有处理中，有效氮含量最高的处理，其比同温度、含水量条件下的对照处理高94.37%。在30 ℃下，接种黑曲霉的处理在含水量40%和50%时其有效氮分别比发酵前增加83.33%和69.72%，分别比对照高56.94%、15.94%。其中黑曲霉+温度30 ℃+含水量40%处理组发酵后有效氮含量为本试验处理中有效氮含量最高。

表2 油茶饼粕固体发酵后有效氮变化†Table 2 Available nitrogen changes after oil-tea cake (Camellia) fermentation

对有效氮进行方差分析（表3）可知，菌种、温度、含水量显示出极显著差异，但互作效应菌种×温度、菌种×含水量和菌种×温度×含水量差异不显著。

表3 油茶饼粕有效氮方差分析及水平间Duncan’s 检验†Table 3 Analysis of available nitrogen variance and Duncan’s test between levels

从各因素水平间的邓肯检验结果，黑曲霉和毛霉处理与对照之间有效氮含量差异极显著，黑曲霉与毛霉之间差异极显著；含水量40%、50%与70%之间的有效氮含量差异极显著，但含水量60%与70%之间的有效氮差异不显著；虽然温度在40 ℃时已无法顺利开展试验，但是30 ℃和20 ℃两个温度组之间有效氮含量表现极显著差异。从有效氮含量的分析结果来看，对于有效氮的保留和转化的优势组合为黑曲霉+温度30 ℃+含水量40%组合以及黑曲霉+温度30 ℃+含水量50%组合，其在本试验中有效氮含量分别为1 678.60、1 554.00 mg/kg，为发酵前原料有效氮含量的1.83、1.70 倍。

3.4.2 油茶饼粕发酵后有效磷比较

油茶饼粕发酵前有效磷含量为822.00 mg/kg，大部分处理的有效磷含量都高于1 000 mg/kg（表4）。其中，提高幅度较大的优势组合为接种毛霉和木霉处理，毛霉+温度30 ℃+含水量50%处理组有效磷含量最高，为1 386.93 mg/kg，比油茶饼粕发酵前有效磷含量增加68.73%，次优组合为木霉+温度20 ℃+含水量70%以及木霉+温度20 ℃+含水量60%组合，两组合有效磷含量分别为1 361.83 和1 243.85 mg/kg，比发酵前增加65.67% 和51.32%，比对照高17.60%、6.10%。在30 ℃时，含水量70%条件下各处理中有效磷含量较发酵前变幅较小，其中，毛霉+温度30 ℃+含水量70%处理组有效磷含量与同条件下黑曲霉处理组相似，其有效磷含量比发酵前只增加14.80%，为本试验处理中有效磷含量最低处理组。

表4 油茶饼粕固体发酵后有效磷变化†Table 4 Available phosphorus changes after oil-tea cake (Camellia) fermentation

对油茶饼粕有效磷进行方差分析（表5），菌种、含水量、菌种×温度、菌种×含水量、温度×含水量互作效应有效磷差异性呈极显著，而温度及菌种×温度×含水量互作效应有效磷差异不显著。

表5 油茶饼粕有效磷方差分析及水平间Duncan’s 检验†Table 5 Analysis of available phosphorus variance and Duncan’s test between levels

在温度水平间邓肯检验（表5）显示，黑曲霉与木霉、对照处理的有效磷含量差异显著，而对照与木霉和毛霉之间差异不显著。从菌种因素效应来看，均值高低排列为木霉＞对照＞毛霉＞黑曲霉，其中木霉处理后的油茶饼粕有效磷均值最高，为1 172.38 mg/kg，在对照组处理中，有效磷含量最高时条件为温度30 ℃+含水量50%，其有效磷含量为1 240.3 mg/kg，分别比同条件下毛霉和黑曲霉处理高15%和20%。20 ℃和30 ℃之间有效磷差异不显著。含水量50%与70%差异显著，但40%、50%和60%之间有效磷含量差异不显著。

3.4.3 油茶饼粕发酵后有效钾比较

油茶饼粕发酵前有效钾含量为6 681.7 mg/kg，发酵后大部分处理的有效钾含量均比发酵前高（表6）。其中，增加幅度较大的是木霉和黑曲霉处理组，其中处理组黑曲霉+温度30 ℃+含水量60%的有效钾最高，为8 509.4 mg/kg，比发酵前和同条件下对照处理分别高27.35%和28.61%，次优处理组为木霉+温度20 ℃+含水量50%以及黑曲霉+温度30 ℃+含水量50%，有效钾含量分别为8 313.5 和8 183.0 mg/kg，比发酵前增加24%和22%，而处理组毛霉+温度20 ℃+含水量70%油茶饼粕有效钾含量最低，比发酵前减少7.80%，为6 159.5 mg/kg。

表6 油茶饼粕发酵后有效钾含量†Table 6 Available potassium changes after oil-tea cake (Camellia) fermentation

对有效钾进行方差分析（表7）可知，菌种、含水量单因素效应和互作效应菌种×温度、菌种×含水量和菌种×温度×含水量中处理后有效钾含量都显示出极显著差异，而温度、温度×含水量效应差异不显著。

表7 油茶饼粕有效钾方差分析及水平间Duncan’s 检验†Table 7 Analysis of available potassium variance and Duncan’s test between levels

从菌种因素各水平间邓肯检验结果来看（表7），黑曲霉、木霉与毛霉、对照之间有效钾含量差异性显著，而黑曲霉、木霉间有效钾含量差异不显著，毛霉与对照间有效钾含量差异不显著。对比表6有效钾均值结果含量，黑曲霉和木霉相对于对照处理有效促进了油茶饼粕有效钾增加。

20 ℃和30 ℃之间有效钾含量差异性不显著。本温度设置水平不是油茶饼粕有效钾起作用的因素。而从有效钾效应均值来看，30 ℃均值高于20 ℃。含水量50%、40%、60%与70%之间有效钾含量差异性显著。从表7可推出较优组合分别为黑曲霉+温度30 ℃+含水量60%、黑曲霉+温度30 ℃+含水量50%、木霉+温度20 ℃+含水量50%、木霉+温度30 ℃+含水量40%，油茶饼粕有效钾含量分别较发酵前增加了27%、23%、24%、21%。

3 结论与讨论

3.1 结 论

黑曲霉与毛霉在油茶饼粕发酵后其有效氮均有明显的提高，并且黑曲霉相对优于毛霉，而在温度上，30 ℃效应有效氮均值比20 ℃要高，4 个含水量中40%比其它3 个含水量更有利于发酵后有效氮的提高，其最优组合为黑曲霉+温度30 ℃+含水量40%、黑曲霉+温度30 ℃+含水量50%，此组合有利于黑曲霉对油茶饼粕有效氮的转化和保留。从有效氮结果来看，黑曲霉的使用有利于油茶饼粕固态发酵，其次为毛霉。

毛霉、在30 ℃下、含水量50%条件下有效磷均高于各自其它水平。关于有效磷在固态发酵过程中的变化，出现不同的研究结果。尹永强等[12]研究结果表明在堆肥过程中有效磷含量变化呈现增加的趋势。Keeling 等[13]认为是有机物的分解产生了有机酸和腐殖质，这些物质由于具有酸性或含有大量酸性基团，从而具有较强的溶解难溶磷的能力。本试验中菌种、温度、含水量效应组合显著，结合实验中有效磷可推出较优组合（毛霉+30 ℃+含水量50%）。

以往的研究结果显示在堆肥过程中速效钾含量呈现增加的趋势。油茶饼粕发酵后有效钾的结果变化中3 种真菌及对照处理中除个别处理出现发酵后有效钾比发酵前稍低外，其它都比发酵前有明显增加。结果显示在20 ℃与30 ℃下黑曲霉与木霉对油茶饼粕发酵后有效钾增加作用明显，并且远优于对照组处理。

综上分析，本研究选出有利于油茶饼粕发酵的菌种为黑曲霉或木霉、温度30 ℃、油茶饼粕含水量为40%或50%时进行固态发酵利于其进一步作为有机肥应用。

3.2 讨 论

目前油茶的研究主要集中在育种、食品与化学等方面[2]，如对抗旱性油茶品种的筛选[14]，在副产品应用上，研究关于果壳对Al3+和Ca2+的吸附性能[15]，但对于副产品之一的油茶茶粕的利用研究还是停留在以前的传统认识。油茶饼粕中茶皂素的存在是限制其直接固态发酵的因素之一，未经处理的油茶饼粕常含有12%～13%的茶皂素，关于茶皂素对微生物的抑制作用已有相关研究，黄卫文等[16]用溶剂法提取油茶枯饼中的皂素对大肠杆菌、桔青霉等6 种真菌进行了抑菌试验，其结果均表明具有抑制作用。茶皂素是一个经济价值较高的日化原料。茶皂素对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌具有明显抑制作用[17]。茶皂素的抑菌机制是通过破坏菌本的正常形态，改变细胞膜和细胞壁的透性，破坏其阻隔性，导致碱性磷酸酶和细胞内容物如K+、蛋白质外汇来实现[18]。因此，有必要考虑油茶饼粕在未脱茶皂素前提下作固态发酵有可能受到阻碍。同时，在本试验中单独用油茶饼粕固态发酵作有机肥，在含水量70%时已经使茶粕处于粘稠状态，不利于微生物的好氧性生长，使得茶粕处于一种厌氧发酵状态，其不利结果是使得氮元素含量损失。

前期工作中[19]已经证明鲁氏毛霉M.roxianus、哈茨木霉T.harzianum和黑曲霉A.niger3 种菌未脱茶皂素与已脱茶皂素的油茶饼粕中生长对比，经过30 d 的观察，结果表明3 种霉菌在未脱茶皂素油茶饼粕中起始生长较慢，其菌丝未能完全遍布到油茶饼粕，在含水量为60%和70%油茶饼粕中会出现黄色油状层；然而，3 种霉菌在已脱茶皂素油茶饼粕中生长较快，其中含水量40%、50%和60%处理中菌丝均能布满在茶粕中。油茶饼粕如果用于固态发酵有机肥，从微生物生长角度考虑[20]，应该采用已脱茶皂素作为发酵材料。同时，由于茶皂素具有非常高的经济价值，茶油生产厂家一般也会经过下游工厂先对油茶饼粕作茶皂素提取再作进一步利用，这也是提高油茶产业链产值的有效方式之一。

氮素的转化过程涉及氨化、硝化、反硝化、挥发等共同作用，并受微环境中氧浓度的影响[21]。在通过发酵处理过程中，氨态氮的转化直接影响到发酵后有效氮的含量，以及整个肥料的肥效。同时，由于传统堆肥腐熟过程是涉及多种自然微生物参与的生理生化过程，而对于油茶饼粕材料来说，其蛋白质含量偏高，氮元素高于其他堆肥材料，如果采用自然发酵方式，则需要考虑多种微生物处理下可能产生的臭气。因而如果利用添加外源微生物来加速该过程，并调控堆制过程中的碳氮代谢，则可通过人为措施极大减少氮类物质分解和臭气的产生。林天杰等[22]采用鸡粪和菜籽饼2 种有机肥进行好气和好气+厌气2 种方式发酵稻草,各养分速效态含量除氮外均因发酵而增大，在堆肥的过程中出现氮素的损失也是堆肥过程中不可避免的结果；为减少氮的损失，赵京音等[23]通过添加微生物制剂EM 来提高堆肥中有机物质和氮素的保留率，减少氮的气态损失。本试验中的油茶饼粕是在有限密闭环境中进行，对有效氮的保留起到一定的作用，试验结果也说明人为添加菌种较其自然发酵更有利于速效态养分的保留和增加，关于油茶饼粕在土壤中的积累过程中对微生物菌群的影响，特别是未脱茶皂素的油茶饼粕，茶皂素的含量一般达到13%，如果将其直接作有机肥施用于田间或林地育苗，茶皂素对土壤微生物的影响还未有研究，对小苗的生长作用在未来可做进一步研究。油茶茶粕由于蛋白质含量高，其作为有机肥应用时也应考虑如何与其他植物废弃物如园林植物废弃物在最适比例混合发酵以使土壤处于更健康状态。本文的下一步工作将在茶粕与其它有机原料混合发酵下展开研究，以达到更好的肥效和更均衡的植物促进作用。