6种临床常用药物对耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的体外抗菌作用

黄晓燕，甘燕玲，曹玲，陈丽丹，王露霞

（中国人民解放军南部战区总医院检验科，广东广州 510010）

随着碳青霉烯酶类抗生素使用的增多，导致耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）出现并呈明显上升趋势，成为临床治疗感染的新挑战。目前对CRKP感染治疗有效的药物种类有限，临床常采用联合用药治疗的方案，因此，临床治疗策略的可行性分析，尤其是治疗药物的最佳搭配方案值得探索。本文选取临床常用抗生素对CRKP进行体外抗菌活性研究，为临床治疗提供实验依据。

1 材料、仪器与试剂

1.1 菌株

收集广州地区某三甲医院2018年10月‒2019年9月临床分离的616株非重复肺炎克雷伯菌，筛选出CRKP37株。其中来源于痰液（包含肺泡灌洗液）25（68%）株、血液5（13%）株、中段尿3（8%）株、引流液2（5%）株、脑脊液1（3%）株、脓液化1（3%）株；标本主要分布在ICU 13（35%）株、老年ICU 10（27%）株、呼吸内科6（16%）株、神经外科4（11%）株、泌尿外科3（8%）株以及血液科1（3%）株。质控菌株大肠埃希菌ATCC8739，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.2 仪器与试剂

运用VITEK MSIVD3.0质谱仪及其配套靶板、基质液（法国生物梅里埃）；Vitek2 Compect鉴定药敏分析系统及其配套药敏卡（法国生物梅埃）；BIORAD基因扩增仪（美国伯乐）；DYY-6C型琼脂糖水平电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；Gel DOCTMXR+凝胶成像系统（美国伯乐）；DNA定量marker（北京天根生化科技有限公司）；核酸染料（北京天根生化科技有限公司）；琼脂糖（西班牙Biow‐est）；96孔平底培养板（无锡耐思生物科技有限公司）；Muller-Hinton（MH）琼脂培养基（广州迪景生物技术有限公司）；Muller-Hinton（MH）肉汤（美国Difco公司）；CAMHB肉汤干粉；多黏菌素B、亚胺培南、米诺环素、磷霉素、多西环素药敏纸片（英国OXOID）；替加环素（上海阿拉丁生化科技有限公司）。

2 方法

2.1 可疑产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的筛选

运用VITEK MSIVD3.0质谱仪鉴定到种，使用Vitek2 Compect鉴定药敏分析系统挑选对美罗培南或亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌株，采用手工K-B法复检，仪器法及手工法均耐药者采用改良Hodge试验进行耐药表型确认。

2.2 改良Hodge试验

用无菌生理盐水制备0.5麦氏单位的大肠埃希菌ATCC25922悬液，10倍稀释后均匀涂布于MH平板，在平板中心贴厄他培南纸片。挑取3～5个血平板上过夜培养的新鲜待测菌和质控菌株肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705菌落，垂直于纸片边缘向外划一条20～25 mm的直线，孵育后观察结果，待测菌株与抑菌环交叉处出现矢状生长的为产碳青霉烯酶阳性株［1］。

2.3 CRKP基因组DNA模板的提取

采用热激法制备CRKP的DNA模板[2]：用无菌棉签将分离纯化的细菌洗脱到200μL无菌蒸馏水中，并置于‒20℃冰箱中1 min。取出后，将其放入预先准备的100℃金属水浴锅中,静置10 min，然后置于‒20℃中保持1 min，然后离心（10 000 r/min）10 min使被裂解的细菌沉淀下来，将上清吸取到新的EP管中，该上清液即为提取的DNA模板溶液，将样品储存在‒20℃冰箱中以备后用。

2.4 肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的扩增

使用PCR技术同时扩增肺炎克雷伯菌的5种碳青霉烯酶基因KPC、IMP、VIM、NDM-1、OXA-48并鉴定。PCR扩增体系（20μL）：DNA模板1μL，上下游引物各1μL，5×PCR mix 10μL，去离子水7μL。PCR反应条件：94℃预变性30 s，94℃变性30 s，KPC、IMP、OXA、VIM、NDM5个基因在各自相对应的退火温度退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环之后72℃彻底延伸5 min。所用引物见表1。

表1 肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因引物序列和预计片段大小Table 1 Primer sequence and predicted fragment size of carbapenemase gene of Klebsiella pneumoniae

2.5 肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因扩增片段电泳鉴定

用980 mL的去离子水与20 mL的50×TAE原液混合，稀释至1×TAE缓冲液，以配置2%琼脂糖凝胶和电泳液。反应结束后，按顺序在泳道内分别加入10μL PCR产物，电压设置为100 V，由负极向正极电泳30 min。电泳结束后，把凝胶放置在紫外光下，用Gel DOCTMXR+凝胶成像系统观察结果并拍照保存。

2.6 单独药敏试验

采用微量肉汤稀释法分别测定6种不同梯度浓度药物对CRKP的体外最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)，记录结果。判断标准参照CLSIM07-A10版，检测时在肉汤培养基中加入25 mg/L的6-磷酸葡萄糖。

2.7 联合药敏实验

采用微量棋盘法，用96孔板进行实验，把多黏菌素B、亚胺培南、米诺环素、替加环素、磷霉素、多西环素（分别以A、B、C、D、E表示）组合成15个不同药物组：A+B、A+C、A+D、A+E、A+F、B+C、B+D、B+E、B+F、C+D、C+E、C+F、D+E、D+F、E+F，检测各药物组MIC联合；同时设定生长对照（只加200μL菌悬液，无药物）和无菌对照（只加200μL肉汤，无细菌）。每个组合各取相应药物50μL，按不同梯度浓度加入96孔板，充分混匀，把浓度为1×106CFU/mL的肺炎克雷伯菌悬液100μL加入所有孔中，使菌液终浓度大约为5×105CFU/mL，充分混匀，置35℃培养箱20 h，记录MIC联合，计算部分抑菌指数（fractitional inhibitory concentration index,FICI）作为联合药敏试验结果的判断依据[3]：FICI=MICA联合/MICA单用+MIC联合/MICB单用，FICI≤0.5，协同作用；0.52.0，拮抗作用。

3 结果

3.1 药物敏感试验结果

结果见图1。37株CRKP菌均为多重耐药菌，对碳青霉烯类、头孢菌素类、氟喹诺酮类药物具有极高的耐药率，均≥80%；对四环素类的多西环素、米诺环素以及氨基糖苷类的阿米卡星、氟喹诺酮类的左氧氟沙星的耐药率是72.2%～79.4%；对添加酶抑制剂的抗生素呈现中敏或高耐，为53.8%～97.9%；对复方新诺明表现为中敏（敏感率57.7%)；对多黏菌素B及替加环素则呈高度敏感（敏感率92.8%、87.8%）。

图1 CRKP药敏结果Figure 1 Drug sensitivity of CRKPstrains(%)

3.2 耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药基因检测结果

PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳结果表明37株菌都是CRKP。见图2。

图2 部分琼脂糖凝胶电泳结果Figure 2 Agarose gel electrophoresis results

3.3 抗菌药物单独及联用对CRKP的体外抗菌作用

3.3.1 实验数据 15种药物组合的MIC联合均比MIC单独值低，见表2。

表2 不同药物单用及联用对CRKP的MIC值Table 2 MICvalues of CRKPin single and combined use of drugs ρ/（μg·mL−1)

3.3.2 计算FICI、数据分析 见表3。结果6种药物相互联合，有协同作用株药物组合的有A+D:13.51%（5/37株），A+E:40.54%（15/37株），B+C:13.51%（5/37株），B+E:75.68%（28/37株），B+F:5.41%（2/37株），C+E:8.11%（3/37株），D+E:16.22%（6/37株），E+F:5.41%（2/37株）；有拮抗作用为A+B:24.32%（9/37株），A+F:27.03%（10/37株），B+C:8.11%（3/37株），B+D:70.27%（26/37株），B+E:8.11%（3/37株），B+F:54.05%（20/37株），C+D:5.41%（2/37株），C+E:13.51%（5/37株），D+E:2.7%（1/37株），E+F:2.7%（1/37株）；其余表现为相加或无关。

表3 CRKP体外联合药敏试验结果Table 3 Results of combined drugs sensitivity test of CRKP in vitro（n=37)

4 讨论

CRKP感染的危险因素包括入住ICU（病情重、住院时间长、免疫力低下、多行开创性治疗）、侵入性操作(有创呼吸机、深静脉置管、尿道插管)、年龄（老年人、新生儿）、合并感染及碳青霉烯类抗菌药物的广泛使用等。目前，对CRKP敏感的药物仅有氨基糖苷类(尤其是庆大霉素)、氨曲南、多黏菌素B、磷霉素及替加环素，但临床治疗没有明确的方案[4-5]，碳青霉烯类药物仍是治疗产超广谱β-内酰胺酶细菌的首选抗生素[6]，进一步导致了碳青霉烯类耐药菌株的出现[7]。据统计，替加环素、多黏菌素对碳青霉烯耐药菌株具有抗菌活性[8]，但单一用药可使病原菌耐药性逐渐增加[9]。有文献报道，磷霉素联合多黏菌素B联合使用，可杀灭65%以上的CRKP，磷霉素不推荐单独使用[10]。也有研究表明，无论是在院病死率、细菌清除失败率和14 d累积生存率，联合用药效果均优于单药（P<0.05）[11]。但目前临床不同药物组合的抗菌疗效少有报道，并不确切。因此，本研究通过实验评价临床上6种常见抗菌药物在单用或联用对CRKP的体外抗菌活性，为临床用药提供参考或依据。结果显示：最优给药方案是多黏菌素B及亚胺培南分别与磷霉素联合，具有显著的协同作用（分别占40.54%和75.68%），这与回顾性研究报道一致[12]。但同时也检测出亚胺培南分别与替加环素及多西环素联合具有明显的拮抗作用（分别占70.27%和54.05%），提示临床用药应避免使用此两种组合给药方案。另外，本实验中亚胺培南联合替加环素应用无协同作用，与Munoz-Price等[13]报道的应用此组合成功治疗CRKP感染病例结果不符，可能是替加环素起到主要抗菌活性作用，碳青霉烯类药物的协同作用仍不清楚。国内外文献中尚未有关于上述3种抗菌药物组合对CRKP的体外抗菌作用的报道，可能是考虑到3种药物联用可能产生的肝、肾毒性过大。目前，市面上热门的新型酶抑制剂复合头孢他啶/阿维巴坦(CAZ/AVI)，是广谱β-内酰胺酶抑制剂阿维巴坦和第三代头孢菌素相结合的抗生素，可抑制ESBLs及AmpC酶、KPC酶和部分D类β-内酰胺酶，抑菌活性虽然弱于替加环素和多黏菌素B，但明显优于美罗培南、亚胺培南、厄他培南、多利培南[14]，具有较好的应用前景。