吡哆醇依赖性癫痫的临床特点与基因特点分析

郭英英，王雪莹，刘 宇，李 丹，杨 琳，黄绍平，杨长虹

(西安交通大学第二附属医院儿科，陕西西安 710004)

吡哆醇依赖性癫痫(pyridoxine-dependent epilepsy, PDE)是一种由antiquitin蛋白缺乏所致的少见的常染色体隐性遗传性癫痫性脑病，新生儿或婴儿期即可发病，常规抗癫痫药物治疗效果差，吡哆醇治疗有效。尽管癫痫可被有效控制，但约75%的患儿合并有不同程度的智力障碍和发育迟缓[1-2]。本研究对收治的4例PDE患儿的临床特点和乙醛脱氢酶7家庭成员A1(aldehyde dehydrogenase 7 family member A1,ALDH7A1)基因突变位点进行分析，旨在提高临床医师对本病临床及分子生物学特征的认识，并为应用维生素B6治疗提供剂量参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象2016年1月至2019年6月于西安交通大学第二附属医院儿科门诊及住院部收治的4例以抽搐发作为主要表现的癫痫患儿，根据起病年龄、临床表现、血液生化等相关检查结果，考虑为PDE。征得患儿父母同意后，抽取患儿及其父母的外周静脉血，提取白细胞基因组DNA进行ALDH7A1基因分析。

1.2 基因分析方法抽取患儿外周静脉血4 mL，采集患儿父母双方的外周静脉血各2 mL，以常规盐析法提取外周血白细胞基因组DNA，DNA通过高温变性，氢键断裂形成单链DNA，通过设计引物，使用PCR技术扩增5号染色体长臂上的致病基因ALDH7A1的外显子及外显子与内含子交界区。具体为引物与DNA模板在60～65 ℃条件下结合形成局部双链，再进一步延伸，合成与模板链相互补的DNA链，进而测序，明确是否有ALDH7A1基因突变。

突变筛查：ALDH7A1基因全长53 550 bp，目前已发现ALDH7A1基因的18个外显子上有80多个不同的突变，其中60%的突变为错义突变，聚集在14、15和16外显子上，第11内含子IVSll + IG>A突变位点，可能是我国PDE患儿中的热点突变。因此，对每例患儿均首先进行IVSll + IG>A的突变筛查，再详细进行ALDH7A1基因的其他突变筛查。对目标序列进行PCR后，采用ABI3730测序仪进行Sanger测序验证，并经序列分析软件得到验证结果。将测序结果与美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)网站数据库进行比对分析，从而确定ALDH7A1具体的变异位点及其类型，再与NCBI SNP和Ensemble数据库及人类基因突变数据库(human gene mutation database, HGMD)详细比对，排除所发现的变异位点为基因多态性位点，进一步确定检测出的突变位点是否为未报道过的新突变位点。

2 结 果

2.1 病例1

2.1.1临床资料 患儿，男，因“发作性抽搐7个月余，加重2 d”于2017年11月就诊于西安交通大学第二附属医院。生后8 d出现抽搐发作，表现为清醒时突然双眼右偏、右上肢僵直，持续3～4 s后自行缓解，间隔2 d后于睡眠中出现呼之不应、双眼凝视、口周发绀、四肢屈曲、双下肢抖动，持续10余秒后缓解。外院诊断为“癫痫”，给予口服“苯巴比妥”治疗无效，反复发作，表现同第2次发作，并容易出现癫痫持续状态，家属自行停药，外院建议基因检查，家属拒绝，逐渐加用“丙戊酸钠口服液、托吡酯及左乙拉西坦片”后，发作减少，但感染期间发作明显增多，程度重，抽搐不易控制，平均半个月发作1次。入院2 d前合并感染后发作频繁，遂来本院。入院后出现癫痫持续状态不易控制，转至本院重症医学科，病情好转后同意行基因检测，确诊为“吡哆醇依赖性癫痫”。患儿母亲孕1产1，患儿足月顺产，出生体质量3.7 kg，生后无窒息史。生后母乳喂养，发育较同龄儿慢，5月龄抬头稳，8月龄可双手撑坐，不能独坐，只会发“啊”音。父母体健，非近亲婚配，无特殊家族史。查体：体质量11 kg，心肺腹查体无明显异常。神经系统查体：四肢肌力、肌张力可，双侧Babinski征对称阳性。

2.1.2实验室检查结果 血尿粪常规、肝肾功、电解质、血氨、乳酸、血尿代谢筛查等均未见异常。

2.1.3影像学及脑电图检查 头颅MRI未见异常。24 h视频脑电图：醒睡各期双侧额、中线区多量尖波、尖慢波、慢波发放，有时左右不同步，有时可波及前颞区，睡眠期显著。

2.1.4基因突变分析 测序结果显示，在受检者5号染色体上的ALDH7A1基因有2个变异。ALDH7A1变异1：c.1008+1G>A(IVS11)，本变异为剪切位点突变，患儿母亲为杂合突变，该突变位点在我国及国外文献中均已有报道[3]，为目前的已知变异。ALDH7A1变异2：c.1547A>G(编码区的第1 547号核苷酸从G变为A)的复合杂合核苷酸变异，患儿父亲为杂合变异，该突变位点尚未发现疾病相关性报道，但该变异导致p.Y516C(17号外显子的第516个氨基酸由Y变为C)，该变异为错义突变，蛋白结构预测有害。

2.1.5治疗及随访 确诊后加用维生素B6口服，每次20 mg，每天3次[5.5 mg/(kg·d)]，未再有抽搐发作，精神运动发育轻度落后，1岁会发“妈妈”“爸爸”等叠音，1岁2月龄可扶站，1岁9月龄能够独走稳。现2岁5月龄，会说短句，口齿不清，正在逐渐减停其他抗癫痫药。

2.2 病例2

2.2.1临床资料 患儿，男，因“发作性抽搐5月余”于2012年10月就诊于西安交通大学第二附属医院。生后40 d出现抽搐发作，表现为双眼向右斜视，每次持续10余秒，每天2～3次，未在意，间隔数天感染后再次发作，表现为双手半握拳，双上肢屈曲抖动，刺激无反应，持续约5 min后缓解，外院按“病毒性脑炎、支气管肺炎”诊治，静脉给予“抗感染、营养神经及维生素B6”等治疗后，患儿未再抽搐。间隔1个月后再次无诱因发作，外院诊断为“癫痫”，加用“丙戊酸钠口服液”，控制不佳，且易出现癫痫持续状态，遂来本院。本院逐渐增加丙戊酸用量后，发作较前减少，但出现血小板低，停用丙戊酸后血小板升至正常，更换为“托吡酯、左乙拉西坦及维生素B6”口服(每次10 mg，每天2次)，仍有发作，每次均为持续状态，持续1～2 h后缓解，每年2次左右。4岁半时发现停服“维生素B6”后发作增多，有一次漏服维生素B6后出现癫痫持续状态，查基因后确诊为“吡哆醇依赖性癫痫”。患儿为第2胎，39周顺产出生，出生体质量2 kg，生后无缺氧史。生后混合喂养。体格发育正常，精神运动发育较同龄儿落后，5月龄会抬头，9月龄会坐，3岁能走稳，4岁半会说简单语句，口齿不清。父母体健，非近亲婚配，哥哥体健，无特殊家族史。查体：口中流涎，言语含混，心肺腹查体无明显异常。四肢肌力、肌张力可，双侧Babinski征对称阴性。

2.2.2实验室检查结果 血尿粪常规、肝肾功、血氨、乳酸、血尿代谢筛查等检查均无异常。

2.2.3影像学及脑电图检查 头颅MRI：双侧大脑半球脑白质较少，双侧侧脑室前角旁异常信号，双侧额颞部蛛网膜下腔增宽。24 h视频脑电图：异常脑电图(2012年)，双侧枕区未见优势节律，弥漫性高波幅δ活动，睡眠结构不完整，睡眠期双侧额区少量棘慢波散发。复查脑电图(2016年)：醒睡各期双侧枕区未见优势节律，各导弥漫性θ、β活动，睡眠期明显增多，NREM期放电指数86.55%；复查脑电图示(2017年)：双侧枕区未见优势节律，各导弥漫性θ、β活动；醒睡各期双侧枕区尖慢波、棘慢波散发或簇发，有时可泛化为广泛性；醒睡各期少量广泛性δ、θ波短程阵发。

2.2.4基因突变分析 测序结果显示，在受检者5号染色体上的ALDH7A1基因有2个变异，ALDH7A1变异1：c.952+5G>A，该变异导致氨基酸剪切突变，患儿母亲为杂合变异，该突变位点在国外已有文献报道[4]，属于目前的已知变异；ALDH7A1变异2：c.1061A>G(编码区第1061号核苷酸由A变成G)，该变异为杂合突变，使第354号氨基酸从酪氨酸转变成半胱氨酸，患儿父亲为杂合突变，该突变位点国外已有文献报道[5]，属于已知突变。

2.2.5治疗及随访 确诊后调整维生素B6口服量为每次30 mg，每天3次[6 mg/(kg·d)]，逐渐减停其他抗癫痫药，至今未再出现抽搐发作。现7岁，可以说来回话，可以唱儿歌，可以和小朋友简单交流，目前已停用托吡酯，正在逐渐减停其他抗癫痫药。

2.3 病例3

2.3.1临床资料 患儿，女，因“发作性抽搐2月”于2016年7月就诊于西安交通大学第二附属医院。6月龄时于睡眠中出现肌阵挛发作，表现为双上肢屈曲抖动1下，每天1～2次，外院按“缺钙”治疗后效果不佳，每日均有1～2次发作。入院前半月开始出现痉挛呈串发作，4～5下/串，4～5串/d，入院后给予大剂量维生素B6(20 mg/kg)静脉滴注，用药期间患儿未再发作，停药3 d后患儿再次复发，但发作次数较之前减少，故维生素B6负荷试验为阳性，进一步行基因检测，确诊为“吡哆醇依赖性癫痫”。患儿母亲孕1产1，患儿足月顺产，出生体质量3.6 kg，生后无缺氧史，3月龄抬头稳，4月龄可侧翻身，6月龄开始会坐，8月龄独坐稳，现8月龄余，不会爬，偶可发“妈妈”等音节。家族史无异常。查体：心肺腹查体无明显异常，双下肢肌张力稍低，独坐稳，扶立时双下肢支撑差，蹬踏动作少，双侧Babinski征对称阳性。

2.3.2实验室检查结果 血尿粪常规、肝肾功、血氨、乳酸、血尿代谢筛查等检查均无异常。

2.3.3影像学及脑电图检查 头颅磁共振及颅脑DWI未见明显异常。24 h视频脑电图：异常脑电图，背景波被大量异常波掩盖，双侧枕区可见少量δ活动，未见正常睡眠周期；醒睡各期弥漫性不规则中-高波幅混合慢波上夹杂大量杂乱多灶性棘波、尖波，左右不对称、不同步，有时呈片段样发放。

2.3.4基因突变分析 测序结果显示，在受检者5号染色体上的ALDH7A1基因有2个变异，变异1：c.1008+1G>A(IVS11)，本变异为剪切位点突变，患儿母亲为携带者，该突变位点在我国及国外文献中均已有报道[3]；变异2：c.1061A>G(编码区第1061号核苷酸由A变成G)，该变异为错义突变，使第354号氨基酸从酪氨酸转变成半胱氨酸，患儿父亲为杂合突变，突变位点国外已有文献报道[5]，属于已知突变。

2.3.5治疗及随访 临床确诊后加用维生素B6口服，每次20 mg，每天3次[6.7 mg/(kg·d)]，未口服抗癫痫药物，未再有抽搐发作。现继续口服维生素，每次B620 mg，每天3次，无抽搐发作。现3岁8月龄，体格发育与同龄儿相仿，会唱儿歌，会说长句，但发音不清晰。

2.4 病例4

2.4.1临床资料 患儿，男，因“发作性抽搐8月”于2019年5月就诊于西安交通大学第二附属医院。生后2个月后开始出现抽搐发作，表现为睡眠中突然双眼上翻、双拳紧握、四肢强直，持续20 min左右缓解，当地脑电图“未见明显异常”，未特殊治疗。间隔1个月后再次出现抽搐发作，表现同前，1个月内共抽搐3次，持续20～40 min，诊断为“癫痫”。本院加用“左乙拉西坦口服液”，仍反复抽搐发作，多为癫痫持续状态，调整左乙拉西坦用量为55 m/kg，并加用维生素B6片10 mg口服，未再出现抽搐发作，行基因检测后确诊为“吡哆醇依赖性癫痫”。患儿母亲孕2产，患儿为足月剖宫产，出生体质量4 kg，生后无窒息史。生后母乳喂养，3月龄抬头稳，5月龄会侧翻身，8月龄会独坐，9月龄会爬，可发“啊啊”音。无特殊家族史。查体：心肺腹查体无明显异常，四肢肌力、肌张力可，双侧Babinski征对称阴性。

2.4.2实验室检查结果 血尿粪常规、肝肾功、血氨、乳酸、血尿代谢筛查等检查均无异常。

2.4.3影像学及脑电图检查 头颅MRI未见异常。24h视频脑电图：异常儿童脑电图，醒睡各期右侧中央、顶、颞区或左枕、颞区非同步尖慢波发放，醒睡各期广泛性尖慢波、棘慢波短程阵发。

2.4.4基因突变分析 测序结果显示，在受检者5号染色体上的ALDH7A1基因有2个变异，ALDH7A1变异1：c.1061(exon12)A>G，该变异为杂合突变，导致第354号氨基酸由酪氨酸变为半胱氨酸，患儿母亲为杂合突变，该突变位点结合ACMG指南(PS1+PM1+PM2+PP3)为可能致病；ALDH7A1变异2：c.575(exon6)C>T，该变异为杂合突变，导致第192号氨基酸由丝氨酸变为蛋氨酸，患儿父亲为杂合突变，该突变位点结合ACMG指南(PM3+PM1+PM2+PP3)为可能致病。上述2个变异与目前的数据库进行详细比对后，发现该突变至今尚无相关文献报道，为新发突变(图 1)。

图1 病例4及父母的ALDH7A1基因测序图

2.4.5治疗及随访 确诊前，加用维生素B6片10 mg[1 mg/(kg·d)]口服后未再有抽搐发作，确诊后加量维生素B6为每次30 mg，每天2次[6 mg/(kg·d)]，拟病情稳定后逐渐减停左乙拉西坦。目前1岁2月龄，体格生长发育与同龄儿相仿，可扶走，可发“爸爸”“妈妈”等叠音。

3 讨 论

PDE属于少见的代谢性异常疾病，是5号染色体长臂上ALDH7A1基因突变引起α-氨基己二酸半醛(α-AASA)脱氢酶缺乏，致使神经抑制性物质γ-氨基丁酸(GABA)的活性降低，从而出现癫痫发作[6]，为常染色体隐性遗传病。PDE的发病率虽然不高，但属于少见的可以治疗的基因异常性疾病。因病源比较分散，临床易误诊、漏诊，因此须详尽询问病史及仔细临床观察，必要时做维生素B6负荷试验排除。PDE的确诊有赖于临床及基因检查，目前尚没有系统性的、有效的诊治方法。

本组4例患儿均为足月顺产，无出生窒息史。其中3例男性，1例女性；4例均早期起病，无诱因频繁抽搐发作；4例均结合基因检测确诊，均对维生素B6治疗有效，小剂量即可迅速控制发作。临床表现多样：①发病时间：4例患儿分别为生后8 d、40 d、2个月及6个月发病，即3例为2月龄内发病，1例为6月龄发病。②发作类型：1例以肌阵挛起病，后转为痉挛发作；1例为全面性发作；2例为部分性发作起病，后转为全面性发作。其中有3例发作时易出现癫痫持续状态。③脑电图：1例不典型高峰失律，3例为背景活动慢，发作间期放电以后头部为主。④口服维生素B6治疗情况：在口服抗癫痫药物基础上，1例口服极少量维生素B6发作即控制，3例口服小剂量维生素B6后发作迅速控制。⑤智能水平：1例重度智力低下，3例轻度语言运动功能迟缓。病例2确诊晚，因早期口服丙戊酸有效，延误了诊断时间，反复发作导致重度智力低下，确诊后给予维生素B6口服后，认知较前明显改善。

本研究发现的ALDH7A1变异：c.1008+1G>A(IVS11)、c.952+5G>A、c.1061A>G均为典型的PDE，已有报道[3-5]。病例1的第2处变异c.1547A>G为首次发现，尚未发现疾病相关性报道，但该变异导致p.Y516C，为错义突变，蛋白结构预测为可能有害，有待继续进行验证。病例4的变异c.1061(exon12)A>G及c.575(exon6)C>T尚未见报道，均为首次发现，经基因比对分析及结合ACMG指南后，确定为新发突变。

PDE的实际发病可能多于现有报道。一方面确诊PDE依靠“常规抗癫痫药抵抗而可被吡哆醇终止，且撤药后发生的癫痫仍可被吡哆醇终止”的标准，但在实际治疗过程中，撤药会导致癫痫反复发作，因而多数患者不同意撤药，故造成确诊困难；另外，PDE的不典型病例较多，如早期对抗惊厥药有效、早期对极少量的维生素B6有反应及停用维生素B6后较长时间才出现惊厥复发等[7-9]；此外，有报道指出，PDE的表型谱很宽，并不限于癫痫发作，部分病例可发生脑积水[10]。TOLDO等[11]也指出，在部分脑畸形患者中存在ALDH7A1突变，建议不仅在经典表型中寻找ALDH7A1突变，而且应该在脑畸形患者中寻找，尤其是对吡哆醇试验有反应的病例，从而提高PDE的诊断率。但需注意的是，先天性低磷酸酯酶症、高脯氨酸血症Ⅱ型等疾病对维生素B6治疗也有反应，只是基因突变点不同。近期，WEMPE等[12]强调对新生儿进行筛查6-氧化-哌可酸盐有助于PDE的诊断，而随着PDE越来越多的ALDH7A1突变位点被报道[13]，PDE的确诊病例将会逐渐增多。

PDE患者需要终生补充吡哆醇[14]。目前，维生素B6的具体治疗剂量并无明确规定，推荐治疗剂量婴儿为15～30 mg/(kg·d)，新生儿可达200 mg/d，成人可达500 mg/d。以上剂量在长期治疗中被证实是安全的[15]，更高剂量的维生素B6可能会引起感觉障碍及运动神经疾病，但这些改变均是可逆的[16]。不同患者对维生素B6的治疗剂量具有个体差异性，一些癫痫发作在很小剂量就得到控制，但其他患者需要更高剂量，胃肠炎或发热性呼吸道感染等急性疾病患者每日吡哆醇剂量可加倍。也有文献指出，PDE对高剂量维生素B6治疗反应较好[17]。需要注意的是，部分患者对维生素B6的反应延迟，所以需要更长的治疗时间[18]。部分PDE患者对亚叶酸治疗有效[8]。GOSPE[19]建议，吡哆醇 15～18 mg/(kg·d)联合叶酸3～5 mg/(kg·d)可作为长期维持治疗。最新报道指出，抑制糖嘌呤途径将来可能会成为治疗PDE的新选择[2]。随着ALDH7A1越来越多的基因位点被报道，PDE的确诊数量明显增加，但应寻找更加快捷可靠的检测手段以提高PDE的早期诊断率，并进一步制定系统性有效的诊治方法。