lncRNA XIST靶向miR-150对LPS诱导的小鼠肺上皮MLE-12细胞凋亡和炎症因子分泌的影响

王慧敏，蔡施霞，周 震，隋 娜

(青岛大学附属医院重症医学科，山东青岛 266003)

急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是由休克、吸入有害气体、感染、创伤等心源性之外的因素引起的弥漫性的肺损伤，主要表现为肺泡水肿、肺组织炎症等[1]。KONG等[2]研究显示，感染尤其是革兰氏阴性菌感染是常见的引起急性肺损伤/ARDS的原因之一。脂多糖((lipopolysaccharide, LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁中的致病成分，其可以诱导肺泡上皮细胞损伤，激活细胞凋亡和炎症因子分泌。肺泡上皮细胞是急性肺损伤发生的靶细胞。lncRNA是当前医学研究领域中的热点，其长度一般大于200 nt，没有编码蛋白质的作用，可以通过和miRNA作用发挥功能[3]。很多研究表明，lncRNA不仅参与细胞生长、胚胎发育，还与很多疾病的进展有关[4]。既往实验研究显示，lncRNA在肺组织损伤中的表达发生改变，而且lncRNA还和肺损伤程度有关[5]。lncRNA XIST来自于X-非特异性的转录因子，在肿瘤、皮肤损伤、心肌肥大等疾病中发挥作用[6]。以前的研究发现，XIST还参与肺组织损伤，XIST在肺炎中高表达，并且敲低XIST抑制肺组织炎症[7]。原发性移植物功能障碍属于常见的急性肺损伤，XIST能够加速原发性移植物功能障碍的发生，而下调XIST可能是治疗原发性移植物功能障碍的途径之一[8]。前期的预实验发现，XIST和miR-150有互补结合位点。以前的研究证实，miR-150在LPS诱导的急性肺损伤以及肺泡上皮细胞损伤中发挥抑制功能[9]。目前尚未见关于XIST靶向miR-150在LPS诱导的肺上皮细胞中的作用探讨。本实验以小鼠肺上皮MLE-12细胞为体外研究对象，以LPS构建体外急性肺损伤细胞模型，探讨XIST靶向miR-150在急性肺损伤中的可能作用，旨在为基因治疗急性肺损伤提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料XIST shRNA、shRNA control、miR-150 inhibitor、inhibitor control、WT和MUT均由北京吉田生物科技有限公司构建；IL-1β含量检测试剂盒购自上海沪震实业有限公司；小鼠肺上皮MLE-12细胞购自上海复祥生物科技有限公司；LPS购自美国Sigma；SOD活性检测试剂盒、MDA含量检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；引物由金唯智生物科技有限公司合成；Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen；ROS检测试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司；TNF-α含量检测试剂盒购自上海信裕生物科技有限公司。

1.2 实验分组及处理MLE-12细胞用含有100 U/mL青链霉素以及100 mL/L胎牛血清的DMEM培养。细胞生长至对数期以后，将MLE-12细胞分成4组，分别为：Control、LPS、sh-NC+LPS、sh-XIST+LPS，Control组为不做处理的对照细胞，LPS、sh-NC+LPS、sh-XIST+LPS组细胞分别在实验开始时用含有1 μg/mL的LPS细胞培养液处理培养24 h。sh-NC+LPS、sh-XIST+LPS组细胞在用LPS处理以前，分别用Lipofectamine 2000在细胞内转染shRNA control、XIST shRNA。细胞转染方法均按照转染试剂Lipofectamine 2000操作进行。

1.3 qRT-PCR检测XIST表达用Trizol试剂抽提细胞中的总RNA，然后取2 μg的RNA，进行cDNA合成反应。首先在RNA中添加1 μL的oligo(dT)，然后用DEPC水补足到12 μL，放在PCR仪上，以70 ℃孵育5 min，然后放在冰上冷却。再分别吸取2 μL的dNTPs、5 μL的5×Buffer、1 μL的反转录酶、1 μL的RNA inhibitor，用移液枪反复吹打混合以后，放在42 ℃孵育60 min，80 ℃孵育5 min，将获取的cDNA放在―20 ℃保存。PCR反应的引物为：内参GAPDH上游(5′-3′)TTCCTACCCCAATGTATCCG，下游(5′-3′)CATGAGGTCCACCACCCTGTT，XIST上游(5′-3′)CCAAGCTTTGCACACGGCCTATCTCATC，下游(5′-3′)CCGCTCG-

AGTGAAAAGAGGTGGGGCATCC。PCR反应体系：2 μL的引物、12.5 μL的2×qPCR mix、2.5 μL的cDNA，然后添加ddH2O至25 μL。PCR条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s；60℃ 60 s，根据2-△△Ct法分析XIST表达水平。

1.4 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡收集各组细胞，在细胞中加入PBS溶液洗涤2次，然后将细胞悬浮在400 μL的Binding Buffer中，吸取5 μL的Annexin V-FITC和PI染色液添加到细胞内，混合以后，放在室温中，避光反应15 min。用流式细胞仪检测。

1.5 Western blotting检测Bax、Bcl-2蛋白表达在细胞内添加RIPA裂解溶液，晃动细胞培养瓶，使裂解溶液与细胞完全接触，将细胞培养瓶放在冰上充分裂解30 min，吹打几次以后，将裂解以后的细胞碎片转移到离心管中，然后设置10 000 g离心10 min。吸取上清溶液，用BCA方法检测浓度以后，置于―80 ℃保存。在蛋白中添加5×Loading Buffer混合以后，放在100 ℃煮沸5 min。制备100 g/L的分离胶以及50 g/L的浓缩胶。在上样孔中按照30 μg蛋白/孔添加样品，设置100 V的电压在浓缩胶中电泳，观察到溴酚蓝进入到分离胶之后，把电压调整为120 V继续电泳。电泳2 h以后，观察到溴酚蓝已经跑到玻璃板的下端，关闭电源。把裁剪以后的NC膜以及分离胶浸泡在转移缓冲液中平衡。设置70 V的电压进行转膜，转膜需要在冰上进行，转膜50 min以后，关闭电源。将NC膜放在封闭液中，于室温中结合2 h，然后将NC膜放在稀释以后的一抗溶液(按照1∶1 000稀释)中，将抗体孵育装置放在4 ℃反应过夜后，于二抗稀释液(按照1∶2 000稀释)中室温结合2 h。按照ECL显色试剂盒显色，分析条带的灰度值。GAPDH设置为内参，分析目的蛋白的表达变化。

1.6 MDA、SOD、ROS水平的检测收集各组细胞，利用TBA法检测MDA含量，利用黄嘌呤氧化法检测SOD活性，利用DCFH-DA法检测ROS水平(结果以相对荧光强度表示)，步骤均按照MDA含量检测试剂盒、SOD活性检测试剂盒、ROS检测试剂盒说明书进行。

1.7 IL-1β、TNF-α水平的检测收集各组细胞培养液上清，利用ELISA法分析 IL-1β、TNF-α水平，步骤均按照IL-1β含量检测试剂盒和TNF-α含量检测试剂盒操作说明书进行。

1.8 靶基因预测和鉴定利用生物信息学软件Starbase分析XIST的可能靶基因(miR-150)，然后利用荧光素酶报告系统鉴定二者的靶向关系。将WT和MUT分别和miR-150 mimics、mimics control共转染到MLE-12细胞中，培养24 h以后，用荧光素酶活性测定试剂盒检测细胞荧光素酶活性变化。WT为含有XIST结合位点的野生型荧光素酶报告载体，MUT为含有突变以后的XIST结合位点的突变型荧光素酶报告载体。收集Control、LPS、sh-NC+LPS、sh-XIST+LPS组细胞，用qRT-PCR方法分析细胞中miR-150的表达变化，内参为U6。引物序列为：U6上游(5′-3′)GCTTCGGCAGCACATAT-

ACTAAAT，下游(5′-3′)CGCTTCACGAATTTGCGTGTCATT；miR-150上游(5′-3′)GCTCTCCCAACCCTTGTC，下游(5′-3′)TGCGTGTCGTGGAGTC。

1.9 逆转实验在MLE-12细胞中分别将XIST shRNA、miR-150 inhibitor和XIST shRNA、inhibitor control共转染，然后用1 μg/mL的LPS细胞培养液处理培养24 h，记为sh-XIST+Anti-miR-150+LPS、sh-XIST+Anti-miR-NC+LPS组。收集细胞，按照上述方法检测细胞凋亡(参照1.4项)和Bax、Bcl-2蛋白表达(参照1.5项)以及MDA、SOD、ROS水平(参照1.6项)和分泌IL-1β、TNF-α水平(参照1.7项)。

2 结 果

2.1 XIST shRNA对LPS诱导的MLE-12细胞中XIST表达的影响与Control组比较，LPS组MLE-12细胞中XIST水平升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与sh-NC+LPS组比较，sh-XIST+LPS组MLE-12细胞中XIST水平降低，差异有统计学意义(P<0.01)。结果显示，XIST shRNA降低了LPS诱导的MLE-12细胞中XIST表达水平(表1)。

表1 XIST shRNA转染对LPS诱导的MLE-12细胞中XIST水平的影响

2.2 下调XIST对LPS诱导的MLE-12细胞凋亡的影响与Control组比较，LPS组MLE-12细胞凋亡率升高，Bax蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达下降，差异均有统计学意义(P<0.05)；与sh-NC+LPS组比较，sh-XIST+LPS组MLE-12细胞凋亡率降低，Bax蛋白表达降低，Bcl-2蛋白表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)。结果显示，下调XIST减弱LPS诱导的MLE-12细胞凋亡作用(图1，表2)。

图1 下调XIST对LPS诱导的MLE-12细胞凋亡以及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

表2 XIST shRNA转染对LPS诱导的MLE-12细胞凋亡率和Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

2.3 下调XIST对LPS诱导的MLE-12细胞氧化损伤的影响与Control组比较，LPS组MLE-12细胞中ROS和MDA水平升高，SOD水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与sh-NC+LPS组比较，sh-XIST+LPS组MLE-12细胞中ROS和MDA水平降低，SOD水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。结果显示，下调XIST减弱LPS诱导的MLE-12细胞氧化损伤(表3)。

表3 XIST shRNA转染对LPS诱导的MLE-12细胞ROS、SOD、MDA水平的影响

2.4 下调XIST对LPS诱导的MLE-12细胞炎症因子分泌的影响与Control组比较，LPS组MLE-12细胞分泌的IL-1β、TNF-α增多，差异均有统计学意义(P<0.05)；与sh-NC+LPS组比较，sh-XIST+LPS组MLE-12细胞分泌的IL-1β、TNF-α减少，差异均有统计学意义(P<0.05)。结果显示，下调XIST减弱LPS诱导的MLE-12细胞炎症因子分泌(表4)。

表4 XIST shRNA转染对LPS诱导的MLE-12细胞分泌IL-1β、TNF-α水平的影响

2.5 下调XIST靶向促进miR-150的表达生物信息学软件预测XIST和miR-150结合位点见图2，荧光素酶报告系统显示，miR-150 mimics和WT共转染以后的细胞荧光素酶活性降低，差异均有统计学意义(P<0.05，表5)。与Control组比较，LPS组MLE-12细胞中miR-150水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与sh-NC+LPS组比较，sh-XIST+LPS组MLE-12细胞中miR-150水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)。结果显示，下调XIST提高LPS诱导的MLE-12细胞中miR-150的表达(表6)。

表5 荧光素酶活性

表6 XIST shRNA转染对LPS诱导MLE-12细胞中miR-150表达的影响

图2 XIST和miR-150结合位点示意图

2.6 miR-150 inhibitor逆转下调XIST影响LPS诱导的MLE-12细胞凋亡、炎症因子分泌和氧化损伤的功能与sh-XIST+Anti-miR-NC+LPS组比较，sh-XIST+Anti-miR-150+LPS组MLE-12细胞凋亡率升高，细胞中Bax蛋白表达增多，Bcl-2蛋白表达减少，细胞分泌的IL-1β、TNF-α增多，细胞中SOD水平降低，ROS和MDA水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05，图3，表7)。

图3 miR-150 inhibitor逆转在下调XIST时对LPS诱导的MLE-12细胞凋亡以及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

表7 miR-150 inhibitor和XIST shRNA转染对LPS诱导的MLE-12细胞凋亡率和Bax、Bcl-2蛋白表达以及ROS、SOD、MDA和分泌IL-1β、TNF-α水平的影响

与sh-XIST+Anti-miR-NC+LPS组比较，*P<0.05。

3 讨 论

急性肺损伤/ARDS是临床上常见疾病，创伤、休克等多种因素都可以诱导肺损伤的发生，而感染诱发的急性肺损伤/ARDS最为常见[10]。LPS是诱导急性肺损伤的常见诱导因子，其可以促进肺组织炎症和氧化损伤[11]。在急性肺损伤发生过程中，肺泡上皮细胞过度凋亡、分泌大量的炎症因子以及氧化损伤等是导致肺功能障碍的重要原因[12]。正常生理状态下，机体内少量的ROS具有维持机体氧化平衡以及信号转导的作用，而当受到外界因素刺激以后，细胞内的抗氧化酶活性降低，导致ROS不能被降解，过量的ROS可以激活细胞凋亡蛋白，诱发细胞凋亡的发生，同时也可以促进细胞内的脂质发生过氧化，造成氧化损伤[13]。SOD是一种抗氧化酶，其可以降低细胞内ROS水平[14]。MDA是脂质发生过氧化的产物，其表达水平的高低与氧化损伤程度有关[15]。Bcl-2是细胞内的凋亡相关蛋白，其含有多个蛋白成员，分别在细胞凋亡过程中发挥不同作用，常见的促凋亡蛋白有Bax等，抗凋亡蛋白有Bcl-2等[16]。IL-1β、TNF-α是常见的促炎因子，其表达升高后诱导组织炎症损伤[17]。也有研究表明，ROS可以促进炎症发生[18]。本研究结果显示，LPS刺激以后的MLE-12细胞凋亡水平升高，细胞中Bax蛋白表达增加，Bcl-2蛋白表达减少，ROS和MDA水平升高，SOD活性降低，细胞分泌的IL-1β、TNF-α增多，说明LPS诱导MLE-12细胞损伤，成功构建了急性肺损伤体外细胞模型。

lncRNA作为现阶段生命科学领域的研究热点，其在疾病靶向基因治疗中具有广泛的应用前景[19]。lncRNA没有编码蛋白质的功能，其可以通过作用于下游基因的表达而发挥复杂的生物学作用[20]。研究报道显示，急性肺损伤受到lncRNA的调控作用，而且lncRNA还与肺组织损伤的程度有关[21]。目前有关于XIST在癌症中的研究较多，其通过调控癌症细胞的凋亡、生长等发挥促进癌症进展的作用[22]。在肺组织损伤中发现，XIST在肺组织炎症中高表达，并且下调XIST可以抑制肺组织炎症，减少肺组织中细胞凋亡水平[7]。原发性移植物功能障碍是急性肺损伤中的一种，下调XIST能够有效减缓原发性移植物功能障碍的发生[8]。本研究表明，LPS诱导的MLE-12细胞中XIST高表达，并且下调XIST抑制LPS诱导的MLE-12细胞凋亡、氧化损伤和炎症因子分泌，提示XIST可能在LPS诱导的急性肺损伤中发挥促进作用，而下调XIST有抵抗急性肺损伤的功能。

miRNA是lncRNA发挥生物学作用的下游靶基因，lncRNA通过与miRNA结合发挥多重作用[23-24]。miR-150是一个在急性肺损伤/ARDS中表达下调的调节因子，上调miR-150可抑制LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型炎症水平，降低LPS诱导的肺泡上皮细胞凋亡和炎症因子分泌[9]。本研究结果显示，下调XIST靶向促进miR-150的表达，并且miR-150在LPS诱导的MLE-12细胞中表达下调，下调miR-150逆转下调XIST对LPS诱导的MLE-12细胞凋亡、氧化损伤和炎症因子分泌的作用，这提示下调XIST作用机制与miR-150有关。

总之， XIST可能是一种急性肺损伤促进因子，下调XIST能够在体外抑制LPS诱导的MLE-12细胞凋亡、氧化损伤和炎症因子分泌，并且其机制与靶向上调miR-150有关。这为研究急性肺损伤分子发生机制奠定了基础，为靶向基因治疗急性肺损伤提供了新方向。本研究尚未涉及miRNA-150的靶蛋白，后续实验将对此进行深入探究。