鱼腥草肝细胞毒性及化学成分研究

高 彬，黎贵凤，孙侨生，马延红，刘文华

(肇庆学院生命科学学院·广东 肇庆 526001)

鱼腥草为三白草科蕺菜属蕺菜(HouttuyniacordataThunb.)带根全草，因新鲜植株茎叶破碎后有浓烈的鱼腥气味而得名，干燥后腥味消散，且略有芳香，为“药食两用”中药。现代药理研究证明鱼腥草具有抗炎、抗菌、抗病毒、增强机体免疫力等作用[1]，2003年“非典”期间，鱼腥草是卫生部推荐的8种抗SARS中药之一，可改善临床症状，减轻炎症反应等[2]。此后，鱼腥草类注射剂产量激增，全国各地接连出现其不良反应报道，甚至出现致死案例，在国家食品药品监督管理局印发《关于暂停使用和审批鱼腥草注射液等7个注射剂的通告》[3]后，决定暂停使用和审批含鱼腥草成分的7个注射剂，随后又审批陆续恢复使用。

《本草纲目》记载:“气味辛、微温、有小毒。”《名医别录》记载:“多食令人气喘。”民间未有食用鱼腥草急性中毒的案例，且上述鱼腥草注射剂事件中，尚不能排除企业粗制滥造及操作不当等人为因素，但有关鱼腥草的安全性研究鲜有报道，应在药理、毒理等各方面对鱼腥草作系统性的研究，以便更好地指导用药。本实验使用不同溶剂依次萃取，得到鱼腥草不同极性段萃取物并进行细胞毒性实验，同时进一步分离并分析其化学成分，旨在探究其毒理性质，丰富鱼腥草化合物信息数据库。

1 材料

1.1 细胞 人胚胎肝细胞系CCC-HEL-1：北京协和细胞资源中心。

1.2 药物与试剂 鱼腥草干品购自肇庆药材市场，经肇庆学院生命科学学院陈雄伟教授鉴定为蕺菜属植物蕺菜的干燥全草。DMEM高糖培养基(含20%胎牛血清)：北京协和细胞资源中心；0.25%胰酶：美国Gibco；磷酸盐缓冲液：美国Gibco；MTT(5 g/L)： 美国Sigma；甲醇(色谱纯)：天津市四友精细化学品有限公司；其余试剂乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、DMSO均为分析纯。

1.3 仪器 500兆赫超导核磁共振谱仪：瑞士Bruker Avance Ⅲ；三重四极杆液相色谱-质谱联用仪：美国TSQ Quantum Ultra；制备液相色谱仪：日本YMC LC-FORTE/R；CO2培养箱：美国Thermo HERAcell 150i；800TS酶标仪：美国Biotek；SY-5000旋转蒸发器：上海亚荣；YMC-Triart C18色谱柱(250 mm×20.0 mm, 5 μm)；Sephadex LH-20凝胶：日本YMC；柱色谱硅胶(200～300目)：青岛海洋化工厂；薄层色谱硅胶板：青岛海洋化工厂；津隆微孔滤膜(0.45 μm)： 天津科亿隆实验设备有限公司。

2 方法与结果

2.1 化合物分离 取鱼腥草全株5 kg，粉碎成粉末状，75%乙醇(料液比1∶4)回流提取2次，合并提取液，减压浓缩得浸膏670.5 g，去离子水悬浮，依次用二氯甲烷、乙酸乙酯及正丁醇萃取，减压浓缩得到二氯甲烷部位浸膏10.07 g、乙酸乙酯部位浸膏18.4 g、正丁醇部位浸膏53.59 g。

二氯甲烷萃取物经正相硅胶柱色谱分离得到10个流分，第7流分以石油醚/乙酸乙酯(10%～40%)梯度洗脱，再经反复硅胶柱色谱分离得化合物1 (8.7 mg)，TLC展开后，在365 nm波长下呈蓝绿色荧光斑点；第8流分用甲醇溶解，经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离及正相硅胶柱纯化后，得到在365 nm下呈蓝色的化合物2 (8 mg)。乙酸乙酯萃取物经正相硅胶柱色谱分离得到9个流分，第4流分经硅胶柱色谱分离后，用甲醇溶解，经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，得到在365 nm下呈黄色的化合物3 (13.2 mg)；第7流分经硅胶柱色谱分离后，用甲醇溶解，经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离及C18反相柱色谱(甲醇/水=20%～50%)梯度洗脱分离得到在365 nm下呈蓝色的化合物4 (7 mg)。

2.2 MTT法鉴定毒性 取少量二氯甲烷部位浸膏、乙酸乙酯部位浸膏、正丁醇部位浸膏分别用DMSO溶解后，加入培养基配置成1 g/L母液(DMSO终浓度≤0.1%)，滤过除菌，冷藏待用。

按照北京协和细胞资源中心提供的标准流程，将CCC-HEL-1培养于含20%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37 ℃, 5% CO2培养箱中，观察细胞生长状态，每3 d传代一次。取对数生长期的CCC-HEL-1，调整浓度为5×104个/mL，以100 μL/孔的量接种于96孔板中，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h后，吸去培养基，用PBS洗2遍。将母液等梯度稀释，给药组加入含不同浓度浸膏的培养基100 μL/孔，对照组加入等量培养基，以上均设3个复孔。在周围加入等量的PBS作为空白调零孔，置于培养箱中培养48 h后，吸去培养基，加入100 μL/孔MTT(5 g/L)，继续培养4 h，吸去上清，加入100 μL/孔DMSO，振荡10 min，测定各孔490 nm处吸光度值。每个处理做3 次重复实验。

细胞存活率(%)=[(OD给药组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)]×100%

2.3 细胞存活率 见表1。

表1 不同极性段萃取物对细胞存活率的影响

2.4 结构鉴定

化合物1：黄绿色针状结晶。APCI-MSm/z∶278.0[M-H]-。1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ∶7.86(1H, s, H-2), 9.12(1H, d, J=8.0 Hz, H-5), 7.57(2H, m, H-6, 7), 7.96(1H, d, J=6.0 Hz, H-8), 7.14(1H, s, H-9), 4.05(3H, s, 4-OCH3), 4.04(3H, s, 3-OCH3), 10.85(1H, s,-NH);13C-NMR(126 MHz, DMSO-d6)δ∶168.4(-CONH-), 121.6(C-4a), 154.3(C-3), 150.4(C-4), 109.9(C-2), 119.9(C-1), 127.5(C-7), 126.9(C-5), 125.9(C-4b), 125.5(C-6), 129.1(C-8), 134.9(C-8a), 104.6(C-9), 135.1(C-10), 123.3(C-10a), 57.0(3-OCH3), 60.0(4-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致[4]，故鉴定为马兜铃内酰胺BⅡ(aristololactam BⅡ)。

化合物2：黄色毛绒状结晶。APCI-MSm/z∶264.0[M-H]-。1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ∶10.66(1H, s,-NH), 9.26(1H, m, H-5), 7.93(1H, m, H-8), 7.77 (1H, s, H-2), 7.54 (2H, m, H-6, 7), 7.13 (1H, s, H-9), 4.05 (3H, s, 4-OCH3);13C-NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ∶57.2 (3-OCH3), 104.4 (C-9), 108.6 (C-2), 114.4 (C-4a), 116.0 (C-1), 124.3 (C-11), 125.0 (C-7), 126.6 (C-6), 127.7 (C-8a), 127.5 (C-5), 128.7 (C-8), 134.2 (C-5a), 135.2 (C-10), 148.2 (C-4), 149.3 (C-3), 169.0 (C-12)。以上数据与文献报道一致[5]，故鉴定为胡椒内酰胺A (piperolactam A)。

化合物3：黄色颗粒状。 ESI-MSm/z: 286.0 [M]+。1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ∶6.17 (1H, d,J=2.1 Hz, H-6), 6.38 (1H, d,J=2.1 Hz, H-8), 8.07 (2H, d,J=8.9 Hz, H-2′, 6′), 6.89 (2H, d,J=8.9 Hz, H-3′, 5′);13C-NMR (126 MHz, CD3OD) δ∶148.0 (C-2), 137.1 (C-3), 177.3 (C-4), 162.5 (C-5), 99.3 (C-6), 165.5 (C-7), 94.5 (C-8), 158.2 (C-9), 104.5 (C-10), 123.7 (C-1′), 130.6 (C-2′, 6′), 116. 3 (C-3′, 5′), 160.5 (C4′)。以上数据与文献报道基本一致[6]，故鉴定为山柰酚(kaempferol)。

化合物4： 棕白色粉末状。ESI-MSm/z∶335.0 [M-H]-。1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ∶6.86 (1H, m, H-2), 4.41 (1H, m, H-3), 3.91 (1H, dd,J= 7.5, 4.2 Hz, H-4), 5.25 (1H, dt,J=7.6, 5.3 Hz, H-5), 2.86 (1H, dd,J=18.3, 5.2 Hz, H-6a), 2.32 (1H, dd,J=18.5, 5.5 Hz, H-6b), 7.05 (1H, d,J= 2.1 Hz, H-2′), 6.78 (1H, d,J= 8.1 Hz, H-5′), 6.95 (1H, dd,J= 8.1, 2.1 Hz, H-6′), 7.56 (1H, d,J=15.9 Hz, H-7′), 6.28 (1H, d,J= 15.9 Hz, H-8′);13C-NMR (126 MHz, CD3OD) δ∶ 130.3 (C-1), 138.9 (C-2), 71.4 (C-3), 70.0 (C-4), 67.3 (C-5), 29.2 (C-6), 169.7 (C-7), 127.7 (C-1′), 116.5 (C-2′), 146.8 (C-3′), 149.7 (C-4′), 115.2 (C-5′), 123.0 (C-6′), 147.3 (C-7′), 115.0 (C-8′), 168.6 (C-9′)。以上数据与文献报道基本一致[7]，故鉴定为 5-咖啡酰基莽草酸(5-O-caffeoylshikimic acid)。

3 讨论

鱼腥草中含有丰富的生物碱[8]，是其活性成分的来源之一，其中颇有争议的是马兜铃内酰胺类(aristololactam, AL)生物碱。AL既是马兜铃酸(aristolochic acid, 一种具有强烈肾毒性的物质)在肝中的代谢产物[9]，又作为一种独立成分广泛存在于自然界；体外细胞实验已证明AL-Ⅰ具有肾细胞毒性，可造成DNA突变，肾间质纤维化等[10-11]；但并非所有AL都具有毒性，且迄今鱼腥草中发现的AL皆无毒。

肝是药物或毒物生物转化的主要场所，本实验横向比较了鱼腥草3 个极性段萃取物对肝细胞的毒性，并发现鱼腥草有毒成分富集在二氯甲烷部位，以往的文献报道中虽未发现鱼腥草含有有毒成分，不能排除其含量低、且脂溶性毒物在体内积蓄的可能，有造成慢性损伤的风险。本次实验只针对浸膏进行了初步毒性鉴定，其中具体成分尚不明确，因此有必要深入研究鱼腥草的化学成分。笔者认为，探明鱼腥草AL物质种类及其活性，将是一个很好的切入点。