肢体内外翻畸形肉鸡腿部骨骼矿物元素含量变化及组织学分析

2021-07-08唐贺贺郭亚苹张真真李转见田亚东康相涛韩瑞丽

畜牧与兽医 2021年7期

唐贺贺,郭亚苹,张真真,李转见,田亚东,康相涛,韩瑞丽

(河南农业大学动物科技学院，河南郑州 450002)

随着对肉鸡生产性能的高强度选育，肉鸡养殖生产效率得到极大提高，但鸡群中骨生长发育异常和腿病问题也日益突出，给肉鸡养殖业造成了严重的经济损失[1]。肢体内外翻畸形(valgus-varus deformity，VVD)是肉鸡常见的长骨畸形病。长骨畸形是指与正常骨相比长骨在结构或形状上发生扭曲。VVD鸡远端胫跗骨会发生一定角度的外翻或内翻，即表现为跗关节内弧或者外撇[2-4]。发病后肉鸡不能正常站立和行走，严重影响采食和动物福利。众多肉鸡品系中，哈伯德肉鸡生长速度快，出肉率高，生产中该品种腿病发生率也相对较高。我们前期调查研究发现，哈巴德肉鸡VVD腿病以单侧外翻为主，患VVD腿病鸡的生长性能明显下降，血钙含量、血磷含量都发生异常改变，碱性磷酸酶的活性受到抑制，骨骼质量降低[5-6]。

矿物元素是骨骼中重要的营养成分，在骨形成和骨吸收过程中发挥着重要作用，钙、磷与灰分是作为评价骨骼性能的重要指标，与骨密度、骨强度等密切相关。钙磷代谢受多种因素影响，任何造成钙磷代谢障碍的因素均会引起不同程度的骨骼疾病[7-9]。此外，微量矿物元素对于动物的正常生长发育也至关重要。铜、锰、锌是在动物机体内含量较低的必需微量元素。铜元素是众多抗氧化酶的组成成分，当机体内缺铜时，抗氧化酶活性降低，影响破骨细胞的活化和增殖，降低骨骼强度[10-11]；锰缺乏能够引起滑腱症和胫骨短粗[12]；如果家禽缺锌，则会导致骨骼矿化[13]。骨生长发育异常可能会对骨组织形态学造成不良影响。骨形成是骨原细胞在骨生长发育期或骨组织修复过程中增殖分化为成骨细胞，进而成熟为骨细胞存在于骨组织内[14]。在这一过程中，成骨细胞和破骨细胞起着关键作用，它们在多种细胞因子的调控下，协同维持骨的代谢平衡。同时，骨小梁对骨的支撑和维持血液等物质转运也起着重要作用。故本试验通过对肉鸡胫骨中钙、磷、灰分、铜、锰、锌元素的含量测定和腿部骨骼切片组织学分析，探究VVD与肉鸡腿部骨骼中矿物元素含量的关系及病理组织学变化情况，旨在为我国肉鸡生产和VVD腿病的研究提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验动物为哈巴德肉鸡，取自辽宁省某养殖公司。

1.2 饲养管理条件

试验肉鸡为笼养方式，7日龄时进行分笼，分笼之前的饲养密度为35只/笼，分笼之后的饲养密度为12只/笼。在1～18日龄，饲喂含1.0% 钙、0.45% 磷、12 331 MJ/kg代谢能和21.5%粗蛋白的统一日粮；19～40日龄，饲喂含0.85% 钙、0.38% 磷、12 958 MJ/kg代谢能和20.0%粗蛋白的统一日粮。肉鸡1日龄注射新城疫疫苗、支原体疫苗和传染性法氏囊病病毒疫苗，7日龄饮水免疫新城疫疫苗，21日龄注射新城疫疫苗。所有肉鸡饲养管理方法一致，自由采食和饮水。

1.3 检测项目与方法

1.3.1 样品采集

试验肉鸡颈静脉放血处死后仰卧位保定，沿腹股沟剪开皮肤和肌肉，找到股骨头所在位置，用手术刀小心将鸡腿部分离，剥离腿部肌肉等附着组织，取股骨、胫骨、跖骨样本，-20 ℃低温保存。

1.3.2 灰分及钙、磷含量的测定

28、38日龄时，分别选取6只VVD腿病鸡和4只健康鸡，对其胫骨进行钙、磷及灰分测定。灰分测定时，先用生理盐水将胫骨内容物充分洗涤，之后用研钵进行充分研磨，随后转移到坩埚中，放入105 ℃烘箱干燥至恒重，最后经电炉碳化至无烟，放到茂福炉中550 ℃灰化，称重，计算胫骨灰分含量。钙、磷测定时，首先将胫骨试样采用干法消化，之后用双蒸水定容至100 mL，采用乙二胺四乙酸二钠(EDTA)络合滴定法测定胫骨钙含量；采用分光光度计法测定胫骨磷含量。测定钙、磷含量时每个样品进行3次重复，取平均值。

1.3.3 铜、锰、锌含量的测定

铜、锰、锌的测定在河南海瑞正检测技术有限公司完成，测定方法为电感耦合等离子体发射光谱法。

1.3.4 组织学检查

甲苯胺蓝染色，组织学分析。切片由武汉赛维尔生物技术有限公司制作。切片具体制作步骤如下：选取38日龄VVD腿病鸡6只，健康鸡4只，采集股骨、胫骨、跖骨，保存在4%的多聚甲醛中，固定液固定24 h以上；将标本浸入脱钙液，放入微波炉10 min，温度不超过40 ℃为宜，之后取出样本，更换脱钙液，置炉内继续重复进行，操作致脱钙完成；将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水；将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋；将修整好的蜡块置于石蜡切片机切片，厚4 μm。在20倍光学显微镜视野下，每张切片随机挑选4个不同区域进行拍照，拍照时尽量让组织充满整个视野，保证每张照片的背景光一致，然后记录软骨细胞数和骨细胞数；对图片中骨小梁之外的骨组织用Adobe Photoshop CS6进行处理，然后应用Image-Pro Plus 6.0软件以图片标尺为标准，将上述处理过的图片中骨小梁全部选中，进行骨小梁面积的计算。

1.4 数据统计与分析

数据采用SPSS 24.0中独立样本t检验进行显著性分析，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著，P>0.05表示差异不显著。结果以“平均值±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 临床检查与腿骨采集

正常肉鸡的站立姿势是在关节处有处轻微弯曲(图1A)，；当肢体偏离身体中线向外弯曲时，这种畸形被归类为外翻(图1B和1C)；相反，当右肢或左肢向内弯曲，被归类为内翻畸形(图1D)。通过记录分析，最早发现这种骨骼畸形出现在7日龄(图1B)。在28和38日龄时，分别选择正常肉鸡4只，VVD肉鸡6只，处死，采集股骨、胫骨、跖骨 (图2A)，观察VVD肉鸡腿骨的形态学变化。如图2A所示，与正常肉鸡长骨相比，VVD鸡长骨形状上发生扭曲；正常肉鸡与VVD肉鸡的胫骨曲度(tibal anteroposterior curvature，Tapc)有明显差异(图2B)。

图1 肉鸡腿部畸形分类

图2 肉鸡腿部骨骼形态学比较

2.2 不同日龄肉鸡腿部骨骼钙、磷和灰分测定

28日龄，正常组和VVD组肉鸡腿骨中钙、磷和灰分含量测定结果如表1所示：VVD鸡胫骨中磷含量显著低于正常组肉鸡(P<0.05)，钙含量和灰分含量差异不明显，但VVD组中钙和灰分含量与正常组相比均有下降趋势。

通过对38日龄正常组和VVD组肉鸡腿骨中钙、磷和灰分含量测定，结果如表2所示：钙、磷和灰分含量差异不显著(P>0.05)，但VVD组肉鸡均低于正常组肉鸡。

表1 28日龄正常组和VVD腿病组肉鸡腿骨中钙、磷及灰分测定结果

表2 38日龄正常组和VVD腿病组肉鸡腿骨中钙、磷及灰分测定结果

2.3 肉鸡胫骨中铜、锰、锌含量测定

如图3所示，38日龄VVD鸡和健康鸡胫骨中铜、锰、锌含量差异均不显著，但VVD鸡胫骨中铜、锰、锌含量均略低于正常组肉鸡。

图3 铜、锰、锌含量测定

2.4 骨组织分析及骨小梁面积、软骨细胞和骨细胞计数

如图4所示，健康鸡骨小梁排列紧密，相互连接，无断裂现象；VVD腿病鸡骨小梁变得稀少，并伴有萎缩断裂现象，骨小梁中白色非矿化区增多，骨细胞数明显减少。如表3所示，VVD组肉鸡股骨、胫骨、跖骨骨小梁面积和骨细胞数均显著或极显著低于正常组肉鸡(P<0.05或P<0.01)；软骨细胞数差异不显著，但VVD腿病组肉鸡软骨细胞数多于正常组肉鸡。

BT.骨小梁；Ch.软骨细胞；Os.骨细胞；UR.未矿化区

表3 38日龄正常组和VVD组肉鸡骨小梁面积、软骨细胞和骨细胞计数

3 讨论

3.1 VVD肉鸡骨骼钙、磷及灰分含量的变化

矿物质在家禽骨骼生长发育过程中起着重要作用。有研究表明，钙、磷缺乏能够导致胫骨生长板肥大区长度增长，骨骺端生长板增生带增宽，影响骨骼的生长性能，使骨强度降低，引起骨骼变形或者挫伤，容易发生骨折[15-16]。前期研究发现，VVD肉鸡血钙、血磷等血液生化指标发生紊乱，骨骼性能降低[4]。故本试验对不同阶段肉鸡腿部骨骼进行钙、磷和灰分含量的测定，以探究骨骼中矿物元素含量的变化情况。结果显示，28日龄VVD肉鸡胫骨磷含量显著低于健康鸡，当机体内矿物质磷代谢发生紊乱时，则会引起不同程度的骨骼疾病[8]，但38日龄VVD肉鸡胫骨磷含量差异不显著，由此推测，VVD腿病可能与胫骨磷含量无关；28、38日龄的钙含量和灰分含量未达到显著差异水平，但与健康鸡相比，均发生降低趋势。说明28、38日龄VVD肉鸡股骨、胫骨、跖骨中矿物元素含量虽然除了28日龄磷含量外，其他均无显著差异，但腿病鸡腿部骨骼中矿物元素含量均发生下降趋势，VVD腿病的发生会对其腿部骨骼中矿物元素含量造成一定影响。

3.2 VVD肉鸡骨骼铜、锰、锌含量的变化

微量矿物元素是指机体内必需且含量小于0.01%的物质，其中铜作为多种酶的辅基，能够影响破骨细胞的活化与增值，促进骨吸收，使骨含量减少[17]；锰缺乏能够引起滑腱症和胫骨短粗，对肉鸡骨骼发育造成影响等[12,18]；有研究发现，锌在骨代谢中发挥着重要作用，可以促进胶原蛋白合成和增加细胞活性，减少由破骨细胞介导的骨吸收[19]。此外，锌可以促进成骨细胞分化，有利于骨的形成[20]。张楠[21]研究发现，在日粮中添加铜、锰、锌等微量元素会对蛋鸡产蛋性能、血浆指标、激素水平等造成影响。由于骨的正常生长发育与骨形成和骨吸收密切相关，而微量矿物元素能够参与骨代谢过程，故本试验首次通过直接对肉鸡胫骨中微量元素的测定，探究VVD腿病与微量元素之间的关系。结果显示健康鸡和VVD肉鸡胫骨中铜、锰、锌含量之间差异不显著，但与健康鸡相比，VVD肉鸡胫骨中铜、锰、锌含量均降低。这说明VVD肉鸡腿骨微量元素含量存在降低趋势，但未达到显著差异水平，猜测可能是肉鸡饲养周期较短所致。VVD腿病的发生与微量元素的关系还有待于进一步探究。

3.3 VVD肉鸡骨骼病理组织学变化

各类腿病的发生常常会引起骨骼组织学的异常变化，骨小梁是长骨端内的网状结构，构成部分包括骨小梁及表面附着的矿物质，其特定的排列方式对骨的支撑起着重要作用[22]。有研究表明，当骨小梁结构损坏时，会降低骨结构性能，易造成骨骼疾病的发生[23]。前期研究结果显示：当肉鸡患VVD后，腿部骨骼骨小梁损伤严重，骨小梁中央存在大量白色的未矿化的区域[5]。本研究骨组织切片分析发现，VVD腿病鸡骨小梁面积显著降低，骨小梁排列稀疏，说明骨量丢失及微结构破坏严重。

软骨细胞在骨骼生长发育这一过程发挥着重要作用，软骨组织的异常改变是腿部疾病发生的重要诱因。田文霞等研究发现，当肉鸡患TD后，发病部位软骨细胞积聚，影响正常细胞分化，最终扰乱软骨成骨这一过程[24]。本研究未发现软骨细胞数存在明显差异，这可能与该腿病的发病程度及发病时间有关，另外VVD腿病的发生对骨组织中软骨细胞数影响较小也是有可能的，但发病后，骨组织中软骨细胞数存在增加趋势。

骨细胞是成熟骨组织中的主要细胞，维持成熟骨的新陈代谢。吕文亭等[25]对笼养蛋鸡综合征(CLO)的研究发现，患CLO蛋鸡骨小梁中骨细胞数量减少。本研究结果显示，VVD腿病鸡骨小梁中骨细胞数显著或极显著低于健康鸡，由此推断VVD会对骨小梁中骨细胞数造成严重影响。因为骨细胞位于骨小梁中，这也与上述结果VVD病鸡骨小梁面积显著降低相符合。