基于Wnt/β-catenin通路探究骨痹通方对软骨基质的保护作用及其机制

鄢泽然，陈光耀，陈嘉琪，徐愿，罗静，陶庆文*

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种以软骨结构损伤为主要特征的退行性病变，与年龄、性别、遗传因素、代谢因素及关节机械损伤等密切相关［1］。据统计，我国40岁以上人群OA发病率为46.3%，OA已成为导致我国老年人残疾的主要原因之一［2］。目前，临床常使用非甾体抗炎药控制疼痛等OA症状，但胃肠道溃疡等一系列不良反应限制了其在临床上的广泛应用［3-4］；氨基葡萄糖类药物虽广泛用于治疗OA，但多项Meta分析结果表明其对OA的治疗效果存疑［5］。因此，基于软骨保护作用开发相关药物以减少OA的发生或延缓OA的进展是OA研究热点之一。

本研究价值：

目前，临床尚缺乏有效治疗骨关节炎（OA）的手段。研究表明，骨痹通方对OA具有较好的临床治疗效果，对OA模型大鼠软骨具有良好的保护作用，但其具体作用机制尚不明确。本研究通过白介素1β介导的SW1353软骨肉瘤细胞建立OA细胞模型，发现骨痹通方可能通过抑制基质金属蛋白酶（MMPs）的过度表达及Wnt/β-catenin通路异常激活而发挥软骨基质保护作用。

本研究局限性：

炎性因子刺激导致软骨细胞释放相关基质水解酶类是导致OA的重要原因，但OA的发生还与软骨细胞凋亡、自噬等因素密切相关，本研究为细胞实验，今后需进一步开展临床研究以探讨骨痹通方治疗OA的具体作用机制等。

既往研究表明，损伤关节腔内软骨细胞与滑膜细胞会在相关炎性因子介导下释放炎性递质及促进软骨基质水解的酶类，进而导致软骨细胞外基质降解及软骨结构损伤，炎性反应与OA的发生、发展密切相关［6］。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是一类依赖Ca2+、Zn2+等金属离子进行活化的酶，与细胞外基质降解密切相关，其中以胶原酶基质金属蛋白酶1（matrix metalloproteinase-1，MMP-1）、基质金属蛋白酶13（matrix metalloproteinase-13，MMP-13）及基质溶解素酶基质金属蛋白酶3（matrix metalloproteinase-3，MMP-3）与OA关系最为密切，是OA发生、发展过程中的关键因子［7-9］。

骨痹通方为首都国医名师阎小萍教授基于多年临床经验创立的治疗OA的有效方剂。一项随机对照试验结果显示，骨痹通方与氨基葡萄糖类药物相比能更有效地缓解和改善膝关节骨性关节炎患者疼痛、僵硬症状及关节功能障碍［10］；另有动物实验结果显示，骨痹通方可有效预防通过Hulth法建立的大鼠OA模型的软骨破坏，但其具体作用机制未明［11］。本研究于2020年6—9月完成，通过白介素1β（interleukin 1β，IL-1β）介导的SW1353软骨肉瘤细胞建立OA细胞模型，旨在基于Wnt/β-catenin通路探究骨痹通方对软骨基质的保护作用及其机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞来源与试剂 SW1353软骨肉瘤细胞（ATCC来源）购自北京中科质检生物技术有限公司；Leibovitiz's L-15培养基（Gibco，美国），胎牛血清（ScienCell，美国），3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTS）（Promga，美国），IL-1β（Peprotech，美国），MMP-1抗体（10371-2-AP，美国），MMP-3抗体（ab53015，Abcam，英国），MMP-13抗体（ab39012，Abcam，英国），β-catenin 抗体（ab32572，Abcam，英国），小鼠抗β-actin抗体（TA-09，中杉金桥，中国），山羊抗小鼠IgG/辣根酶标记（ZB-5305，中杉金桥，中国），山羊抗兔IgG/辣根酶标记（ZB-2301，中杉金桥，中国），10%变性预制胶（普利莱，中国），反转录试剂盒（A3500，Promga，美国），SYBR Green Realtime PCR Master Mix（QPK-201，TOYOBO，日本），Ripa裂解液（索莱宝，中国），甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）（索莱宝，中国），HiPure Total RNA Mini Kit（美基，中国）；实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）引物由擎科生物科技合成，引物序列详见表1；MMP-3酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 试 剂 盒（R&D，USA），MMP-1、MMP-13 ELISA试剂盒（Novus Biologicals，USA）。

表1 实时定量PCR引物序列Table 1 Real-time PCR primer sequence

1.2 骨痹通方药物组成及制作方法 骨痹通方由骨碎补20 g、淫羊藿15 g、补骨脂15 g、杜仲30 g、狗脊30 g、土贝母20 g、青风藤30 g、鸡血藤30 g组成，使用前需对上述药材进行清捡并粉碎成直径为2～3 cm碎片，之后经去离子水浸泡、提取、过滤得到含中药成分溶液，最后离心除去杂质并进行浓缩、干燥，备用；使用时加入磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）并根据实验要求配置成浓度为500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 mg/L的骨痹通方溶液，注意使用除菌过滤器进行过滤。

1.3 细胞培养方法 将SW1353软骨肉瘤细胞置于含90% Leibovitiz's L-15培养基、10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 mg/ml链霉素的完全培养基中，并密封放置于37 ℃孵箱。

1.4 观察指标

1.4.1 SW1353软骨肉瘤细胞活力 采用MTS法检测SW1353软骨肉瘤细胞活力：将SW1353软骨肉瘤细胞种植于96孔板中，每孔种植2万个细胞，分别加入浓度为500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 mg/L的骨痹通方溶液〔设置3个副孔和空白对照孔（骨痹通方溶液浓度为0）〕；使用封口膜进行密闭并置于37 ℃孵箱中孵育12 h后弃去培养基；使用PBS冲洗2次后置于Leibovitiz's L-15培养基继续培养2 h，并在每孔加入MTS 20 μl；1 h后将96孔板置于酶标仪上并检测490 nm波长处光密度（optical density，OD）值。将正常SW1353软骨肉瘤细胞活力设定为100%，计算不同浓度的骨痹通方溶液干预后SW1353软骨肉瘤细胞活力，计算公式：细胞活力（%）=（加入骨痹通方溶液孔OD值-培养基OD 值）/（空白对照孔OD值-培养基OD值）×100 ×100%。

1.4.2 MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA表达情况 采用实时荧光定量PCR检测MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA表达情况：将SW1353软骨肉瘤细胞种植于6孔板中，每孔种植70万个细胞，设置A组、B组、C组、D组、E组（每组设置两个副孔），其中A组为空白对照，B组为阳性对照（加入10 μg/L的IL-1β），C组、D组、E组加入10 μg/L的IL-1β后分别加入低剂量（625 mg/L）、中剂量（1 250 mg/L）、高剂量（2 500 mg/L）骨痹通方溶液；使用封口膜进行密闭并置于37 ℃孵箱中孵育12 h，之后吸取培养基并使用PBS冲洗2次；按照试剂盒说明书，采用HiPure Total RNA Mini Kit试剂盒提取总RNA 1 μg并反转录形成cDNA；采用SYBR Green Realtime PCR Master Mix 20 μl反应体系进行PCR扩增，并计算MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA相对表达量，即MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA表达量除以β-actin表达量。

1.4.3 MMP-1、MMP-3、MMP-13、β-catenin蛋白表达情况 采用Western-blotting检测MMP-1、MMP-3、MMP-13、β-catenin蛋白表达情况：将SW1353软骨肉瘤细胞种植于6孔板中，每孔种植70万个细胞，设置A组、B组、C组、D组、E组（每组设置两个副孔），其中A组为空白对照，B组为阳性对照（加入10 μg/L的IL-1β），C组、D组、E组加入10 μg/L的IL-1β后分别加入低剂量（625 mg/L）、中剂量（1 250 mg/L）、高剂量（2 500 mg/L）骨痹通方溶液；使用封口膜进行密闭并置于37 ℃孵箱中孵育12 h，之后依次加入Ripa裂解液进行裂解、加入上样缓冲液并进行煮沸；使用10%变性预制胶进行电泳，电泳结束后转膜至经甲醇活化的聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上；封闭1 h后加入相应的稀释后的一抗（MMP-1、MMP-3、MMP-13、β-actin稀释浓度分别为 1∶2 500、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000）并在4 ℃条件下过夜；使用TBST（Tris缓冲液+Tween-20）进行清洗并加入相应的稀释后的二抗，孵育1 h后再次使用TBST清洗，最后进行曝光。

1.4.4 MMP-1、MMP-3、MMP-13分泌情况 采用ELISA检测MMP-1、MMP-3、MMP-13分泌情况：将SW1353软骨肉瘤细胞种植于6孔板中，每孔种植70万个细胞，设置A组、B组、C组、D组、E组（每组设置两个副孔），其中A组为空白对照，B组为阳性对照（加入10 μg/L的IL-1β），C组、D组、E组加入10 μg/L的IL-1β后分别加入低剂量（625 mg/L）、中剂量（1 250 mg/L）、高剂量（2 500 mg/L）骨痹通方溶液；使用封口膜进行密闭并置于37 ℃孵箱中孵育12 h后收集细胞培养液，10 000 r/min离心5 min（离心半径5 cm）后取上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测细胞上清液MMP-1、MMP-3、MMP-13含量，使用酶标仪获取每孔OD值，使用Curve Expert 1.4软件及拟合标准曲线计算细胞上清液MMP-1、MMP-3、MMP-13含量。

1.5 统计学方法 采用GraphPad Prism 4进行制图与分析，采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析及Dunnett-t检验。双侧检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 SW1353软骨肉瘤细胞活力 浓度为500、1 000、1 500、2 000、2 500 mg/L的骨痹通方溶液对SW1353软骨肉瘤细胞活力未见明显影响，但浓度为3 000 mg/L的骨痹通方溶液对SW1353软骨肉瘤细胞活力有一定抑制作用（P＜0.05），见图1，因此将2 500 mg/L作为骨痹通方溶液干预SW1353软骨肉瘤细胞的最大浓度（高剂量），将最大浓度的0.50倍作为中剂量浓度，将最大浓度的0.25倍作为低剂量浓度。

图1 不同浓度骨痹通方溶液对SW1353软骨肉瘤细胞活力的影响Figure 1 Effect of different concentrations of Gubitong Recipe solution on viability of SW1353 chondrosarcoma cells

2.2 MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA表达情况 五组细胞MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；B组、C组、D组、E组细胞MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA相对表达量高于A组，但C组细胞MMP-1、MMP-3 mRNA相对表达量低于B组，D组、E组细胞MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA相对表达量低于B组、C组，E组细胞MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA相对表达量低于D组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图2 五组细胞MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA相对表达量Figure 2 Relative mRNA expression quantities of MMP-1，MMP-3，MMP-13 in the five groups of cells

2.3 MMP-1、MMP-3、MMP-13 蛋白表达情况 五组细胞MMP-1、MMP-3、MMP-13蛋白相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；B组、C组、D组、E组细胞MMP-1、MMP-3、MMP-13蛋白相对表达量高于A组，但C组细胞MMP-1、MMP-3蛋白相对表达量及D组、E组细胞MMP-1、MMP-3、MMP-13蛋白相对表达量低于B组，D组细胞MMP-1、MMP-13及E组细胞MMP-1、MMP-3、MMP-13蛋白相对表达量低于C组，E组细胞MMP-1、MMP-3、MMP-13蛋白相对表达量低于D组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图 3～4。

图3 五组细胞MMP-1、MMP-3、MMP-13蛋白电泳图Figure 3 Electrophoresis of MMP-1，MMP-3，and MMP-13 protein in the five groups of cells

图4 五组细胞MMP-1、MMP-3、MMP-13蛋白相对表达量Figure 4 Relative protein expression quantities of MMP-1，MMP-3，MMP-13 in the five groups of cells

2.4 MMP-1、MMP-3、MMP-13 分泌情况 五组细胞上清液MMP-1、MMP-3、MMP-13含量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；B组、C组、D组、E组细胞上清液MMP-1、MMP-3、MMP-13含量高于A组，但C组、D组、E组细胞上清液MMP-1、MMP-3、MMP-13含量低于B组，D组、E组细胞上清液MMP-1、MMP-3、MMP-13含量低于C组，E组细胞上清液MMP-1、MMP-3、MMP-13含量低于D组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图5。

图5 五组细胞上清液MMP-1、MMP-3、MMP-13含量Figure 5 Contents of MMP-1，MMP-3，MMP-13 in the supernatant solution in the five groups of cells

2.5 MMP-13、β-catenin蛋白表达情况 分别在B组基础上加入5 μmol/L Wnt/β-catenin通路激活剂WAY-262611溶液（F组）、10 μmol/L地塞米松溶液（G组）。七组细胞MMP-13、β-catenin蛋白相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；B组、C组、D组、E组、F组、G组细胞MMP-13、β-catenin蛋白相对表达量高于A组，F组细胞MMP-13、β-catenin蛋白相对表达量高于B组、C组、D组、E组、G组，但D组、E组、G组细胞MMP-13蛋白相对表达量及E组、G组细胞β-catenin蛋白相对表达量低于B组、C组，G组细胞MMP-13蛋白相对表达量及E组、G组细胞β-catenin蛋白相对表达量低于D组，G组细胞MMP-13、β-catenin蛋白相对表达量低于E组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图 6～7。

图6 七组细胞MMP-13、β-catenin蛋白电泳图Figure 6 Electrophoresis of MMP-13 and β-catenin protein in the seven groups of cells

图7 七组细胞MMP-13、β-catenin蛋白相对表达量Figure 7 Relative protein expression quantities of MMP-13 and β-catenin in the seven groups of cells

3 讨论

在机械刺激、炎性因子及自身衰老等因素作用下软骨细胞基质降解相关酶类释放增多并导致软骨基质异常降解、软骨结构损伤是OA的主要发病机制［8］。笔者所在课题组前期研究发现，骨痹通方对OA具有良好的临床疗效及较好的软骨保护作用，但其具体作用机制尚不完全明确［6-7］。通过炎性因子IL-1β介导的SW1353软骨肉瘤细胞建立OA细胞模型较直接使用人或动物软骨细胞建立的OA模型具有稳定、可重复性良好等优点，是开展OA研究的经典细胞模型。本研究结果显示，B组细胞MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA、蛋白相对表达量及上清液含量高于A组，提示OA细胞模型复制成功；C组、D组、E组细胞MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA、蛋白相对表达量及上清液含量相较B组出现不同程度降低，提示骨痹通方对软骨细胞基质水解酶的合成与释放具有一定抑制作用，对软骨基质具有一定保护作用且存在一定剂量依赖效应，而抑制MMPs的过度表达可能是骨痹通方发挥软骨基质护作用的机制之一。

Wnt信号途径指配体蛋白Wnt与相关膜蛋白受体结合后进一步激活多个下游通道的信号转导途径；既往研究表明，Wnt/β-catenin通路的异常激活与纤维化、肿瘤、自身免疫炎性疾病等密切相关［12-14］，而Wnt信号激活后抑制细胞质β-catenin蛋白降解并最终易位至细胞核中激活相关基因转录是Wnt/β-catenin通路的经典途径［15］。研究表明，Wnt/βcatenin通路激活会通过促进软骨细胞基质水解酶类的表达而诱导软骨基质降解，Wnt/β-catenin通路与OA患者软骨特异性细胞外基质降解密切相关［16-18］，因而抑制Wnt/β-catenin通路可作为OA的潜在治疗策略［16］。本研究结果显示，B组细胞β-catenin蛋白相对表达量高于A组，提示OA细胞模型Wnt/β-catenin通路异常激活，与既往研究结果一致［19］；F组细胞β-catenin蛋白相对表达量高于B组，但E组、G组细胞β-catenin蛋白相对表达量低于B组，G组细胞β-catenin蛋白相对表达量低于E组，表明高剂量（2 500 mg/L）骨痹通方对Wnt/β-catenin通路异常激活有一定抑制作用，而联用地塞米松可在一定程度上增强高剂量（2 500 mg/L）骨痹通方对Wnt/β-catenin通路异常激活的抑制作用，抑制Wnt/βcatenin通路异常激活可能是骨痹通方发挥软骨基质保护作用的机制之一。

综上所述，骨痹通方对软骨基质具有一定保护作用且存在一定剂量依赖效应，抑制MMPs的过度表达及Wnt/βcatenin通路异常激活可能是其发挥软骨基质保护作用的重要机制。

作者贡献：鄢泽然负责文章的构思、研究的设计、基金项目的申请；鄢泽然、陈光耀进行实验操作；鄢泽然、陶庆文负责文章的质量控制；陈光耀进行数据收集及论文撰写；陈光耀、陈嘉琪进行统计学处理；陈嘉琪负责制图；徐愿、罗静指导实验操作，负责数据核对；陶庆文负责文章的审校，对文章整体负责。

本文无利益冲突。