结直肠癌患者MOS基因表达情况及其与患者临床病理特征和预后的关系研究

彭俊付，彭继升，王锐，刘超，王振彪

本研究背景：

结直肠癌是严重威胁我国居民健康的常见恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率分别居我国恶性肿瘤的第三位和第四位。目前，结直肠癌的具体发病机制尚不完全清楚，关于MOS基因与结直肠癌生物学特征及患者预后关系的研究报道少见。

本研究价值：

本研究通过检测结直肠癌患者癌组织和癌旁组织MOS基因表达情况发现，MOS基因在结直肠癌组织中的高表达与肿瘤浸润程度及患者预后不良相关，提示MOS基因有可能作为结直肠癌发生、发展及预测患者预后的有价值的生物标志物。

本研究局限性：

本研究样本量有限，未能深入探索原癌基因MOS基因在结直肠癌进展中的具体作用及相关机制。

结直肠癌是全世界范围内常见的消化系统恶性肿瘤之一，其发病率位居所有恶性肿瘤第四位，死亡率高居所有恶性肿瘤第二位［1］。有公开研究数据显示，仅2015年间我国新发结直肠癌患者多达38万人（包括男性患者22万人和女性患者16万人），因结直肠癌死亡的患者多达19万人（包括男性患者11万人和女性患者8万人）；结直肠癌发病年龄段集中在60～74岁（占总体新发患者的41%）；45岁以上患者占总体新发患者的93%，因结直肠癌死亡率高达95%［2-3］。因此，结直肠癌已成为严重危害我国居民特别是中老年人群身体健康的重大疾病，而提高结直肠癌诊疗水平是目前亟须解决的医疗难题之一。

深入了解结直肠癌发生发展的病理生理机制、发现与结直肠癌进展有关的生物标志物对结直肠癌的早期诊断及靶向治疗具有极其重要的临床意义［4-5］。MOS基因是一种原癌基因，主要编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶并可通过直接磷酸化MEK而激活MAPK信号通路［6］。生理状态下，MOS蛋白在胚胎阶段或发育中的生殖系统（如卵巢、睾丸、附睾组织）中表达水平较高，在发育成熟的组织中表达水平较低［7］。既往研究表明，MOS蛋白在卵细胞的发育、成熟及睾丸雄性生殖细胞分化过程中发挥着重要作用［8-9］；近年研究发现，MOS基因表达异常与畸胎瘤［10-11］、小细胞肺癌［12］、非小细胞肺癌［13］、卵巢腺癌［14］、甲状腺髓样癌［15］等恶性肿瘤的发生、发展密切相关，但MOS基因与结直肠癌的关系尚不清楚，关于结直肠癌患者MOS基因表达情况及其临床意义的研究报道较少见。本研究旨在分析结直肠癌患者MOS基因表达情况及其与患者临床病理特征和预后的关系，以期为结直肠癌的诊断、预后评估、生物标志物及治疗靶点研究等提供参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2009年10月—2019年6月在首都医科大学附属北京世纪坛医院初诊为结直肠癌并行手术治疗的患者86例作为研究对象，其中男49例，女37例。纳入标准：（1）术前未行新辅助放、化疗或其他治疗；（2）术后经病理检查证实为原发性结直肠癌；（3）肿瘤组织及癌旁组织均保留有液氮冷冻标本；（4）临床、病理及随访资料完整。排除标准：（1）年龄＜18岁或＞80岁；（2）有其他肿瘤病史；（3）伴有家族性结肠息肉病等遗传性疾病；（4）合并其他部位肿瘤或消化道疾病。

1.2 方法 采用动物组织总RNA提取试剂盒〔RNAprep pure Tissue Kit，天根生化科技有限公司（北京）〕提取所有患者结直肠癌组织及癌旁组织RNA，提取产物的OD260/OD280比值控制在1.8～2.0；采用反转录试剂盒〔TIANScript RT Kit，天根生化科技有限公司（北京）〕合成第一链cDNA；以编码磷酸甘油醛脱氢酶的GAPDH基因作为内参基因（GAPDH正向引物序列为5'-GACTCACCCTGCCCTCAATA-3'，反向引物序列为5'-CCCTGTAGCCTGGACCTGAT-3'），MOS基因正向引物序列为5'-CGGTGTTCCTGTGGCCATAA-3'，反向引物序列为5'-AGCAGGCCGTTCACAACATC-3'。

聚合酶链反应（PCR）条件：95 ℃预变性3 min，94 ℃ 30 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s循环 40 次，72 ℃延伸5 min；取PCR产物10 μl，采用2%琼脂糖凝胶进行电泳以确定扩增产物长度是否符合预期，并将PCR产物送至上海生工生物工程股份有限公司进行基因测序以确定扩增产物是否为预期基因序列；采用SYBR Green试剂盒（Takara，日本）对cDNA进行实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR），引物序列同上。RT-qPCR体系包括SYBR® Premix Ex Taq（2×）（Tli RnaseH Plus）10 μl、cDNA 2 μl、 上 游 引 物 0.4 μl、 下 游 引 物0.4 μl、ROX Reference Dye（50×）Ⅱ 0.4 μl、去离子水 6.8 μl，条件：95 ℃预变性 3 min，95 ℃ 5 s、60 ℃34 s循环40次。采用ABI 7500型实时荧光定量PCR系统进行扩增，重复3次取平均值。采用2-ΔΔCt法计算MOS基因相对表达量。

1.3 随访情况 所有患者出院后进行门诊随访或电话随访；以失访（作为删失数据）或患者死亡为随访终点，随访截至2020年8月。

1.4 统计学方法 采用SPSS 24.0统计学软件进行数据分析。经 Kolmogorov-Smirnov检验，本研究所有计量资料符合正态分布，以（±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验。计数资料以相对数表示，组间比较采用χ2检验。绘制Kaplan-Meier生存曲线以分析患者生存情况，生存曲线的比较采用Log-rank检验。MOS基因表达情况与结直肠癌患者预后的关系分析采用Cox比例风险回归模型分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌组织MOS基因表达情况 结直肠癌组织MOS基因相对表达量为（4.56±2.17），高于癌旁组织的（3.12±1.65），差异有统计学意义（t=5.636，P＜0.001），见图 1。

图1 结直肠癌组织与癌旁组织MOS基因相对表达量比较Figure 1 Comparison of relative expression quantity of MOS gene between colorectal cancer tissues and paracancerous tissues

2.2 MOS基因表达水平与结直肠癌患者临床病理特征的关系 根据结直肠癌组织MOS基因相对表达量的平均值（3.76±2.20）将所有患者分为MOS高表达组（n=43）和MOS低表达组（n=43）。两组患者性别、年龄、肿瘤分化程度、淋巴结转移发生率、远处转移发生率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；MOS高表达组患者中TNM分期为T3～4期者所占比例高于MOS低表达组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 MOS基因表达水平与结直肠癌患者临床病理特征的关系〔n（%）〕Table 1 Relationship between MOS gene expression level and clinicopathological features of patients with colorectal cancer

2.3 MOS基因表达水平与结直肠癌患者预后的关系所有患者随访6～125个月，中位随访时间为61.3（24.8，97.8）个月。绘制Kaplan-Meier生存曲线发现，MOS高表达组、MOS低表达组患者中位生存期分别为101个月〔95%CI（92.4，112.6）〕、116个月〔95%CI（105.6，128.7）〕，两组患者Kaplan-Meier生存曲线比较，差异有统计学意义（χ2=4.984，P=0.029），见图2。

图2 MOS高表达组和MOS低表达组患者的Kaplan-Meier生存曲线Figure 2 Kaplan-Meier survival curves for patients with high and low expression of MOS gene

以MOS基因表达水平及患者临床病理特征为自变量，以结直肠癌患者预后为因变量进行Cox比例风险回归模型分析（变量赋值见表2），结果显示，MOS基因高表达、淋巴结转移、远处转移是结直肠癌患者预后不良的独立危险因素（P＜0.05），见表3。

表2 结直肠癌患者预后影响因素Cox比例风险回归模型分析的变量赋值Table 2 Variable assignment in Cox proportional hazards regression analysis of prognostic factors in patients with colorectal cancer

表3 结直肠癌患者预后影响因素的Cox比例风险回归模型分析Table 3 Cox proportional hazards regression analysis of prognostic factors in patients with colorectal cancer

3 讨论

结直肠癌是一种在生物学上存在高度异质性的恶性肿瘤，多数结直肠癌患者在确诊时即已处于中晚期，预后较差。近年来，随着分子靶向治疗和免疫治疗在肿瘤临床治疗中的推广与应用，结直肠癌的分子病理诊断与临床治疗也已进入一个新阶段，而针对结直肠癌生物标志物的研究对于结直肠癌的早期诊断、有针对性地制定临床治疗方案、准确进行预后评估均具有重要临床意义。目前，针对结直肠癌生物标志物的研究主要涉及KRAS基因、NRAS基因、BRAF基因、PI3KCA基因、人类表皮生长因子受体2（HER2）基因、癌胚抗原（CEA）等［16］。

既往研究表明，30%～45%的结直肠癌患者存在KRAS基因突变，4%的结直肠癌患者存在NRAS基因突变，KRAS、NRAS基因突变均可引起表皮生长因子受体（EGFR）-RAS-ERK信号通路异常激活，进而导致结直肠癌对抗EGFR化疗药物产生耐药性［17］。此外，KRAS基因突变还可作为结直肠癌患者预后不良的生物标志物［18-19］。BRAF基因所编码的蛋白产物是RASMEK-MAPK信号通路的关键调控因子，与肿瘤细胞生长、分化、凋亡、自噬等多种生物学效应密切相关。有研究表明，5%～15%的结直肠癌患者存在BRAF基因功能性突变，其中V600E突变与结直肠癌患者预后不良密切相关［20］。另有研究表明，存在BRAF基因突变的结直肠癌患者复发率明显升高，因此BRAF基因可作为预测结直肠癌复发的生物标志物［21］。近年来，多种孤立的生物标志物被陆续发现，如SFAKIANAKI等［22］研究发现，PKM2基因高表达的结直肠癌患者无病生存期及总生存期均明显短于PKM2基因低表达者，且PKM2基因表达水平可作为结直肠癌患者对奥沙利铂耐药的生物标志物。

MOS基因位于8号染色体（8q11-12），编码39-kDa的蛋白，并主要通过MAPK信号通路介导而发挥生物学效应，其中较为重要的生物学效应是对脊椎动物细胞减数分裂的调控作用。动物实验表明，MOS基因敲除小鼠体内存在由于卵子细胞周期异常终止而导致的生育力严重损伤［23］。研究表明，正常组织中MOS基因及其编码的蛋白表达水平较低，且在不同组织中二者表达水平存在显著异质性，但MOS基因在体细胞中的具体作用目前尚不清楚［24］；MOS蛋白可与多种细胞功能相关蛋白相结合，如vimentin波形蛋白、tubulin微管蛋白及热休克蛋白hsp70、p34、p35等［25-27］。PERUNOVIC等［23］研究发现，体细胞中MOS基因表达水平升高与肿瘤转化密切相关，其可能的作用机制包括以下两个方面：（1）MOS-MAPK信号通路异常激活通过干扰体细胞Cyclin D1-Cdk4-pRb-E2F信号通路而扰乱正常的细胞周期［28］；（2）MOS基因表达水平升高导致体细胞获得减数分裂样表型，进而导致有丝分裂检查点异常［29］。此外，还有研究表明MOS基因在肺癌组织中高表达并会促进肿瘤细胞生长、对相对良好的患者预后具有负面影响［30］。

本研究结果显示，结直肠癌组织MOS基因相对表达量高于癌旁组织，MOS高表达组患者中TNM分期为T3～4期者所占比例高于MOS低表达组且两组患者Kaplan-Meier生存曲线间存在统计学差异，MOS基因高表达是结直肠癌患者预后不良的独立危险因素之一，提示MOS基因高表达与结直肠癌浸润程度及患者预后不良相关，并有可能作为结直肠癌发生、发展及预测患者预后的有价值的生物标志物，也可能成为结直肠癌患者的潜在治疗靶点，而作为原癌基因，MOS基因在肿瘤进展中的作用、对结直肠癌细胞生物学效应及包括MAPK信号通路在内的信号通路的影响、相关作用机制等仍需继续深入探索。

作者贡献：彭俊付进行文章的构思、研究的设计与可行性分析，撰写论文；彭继升进行论文及英文的修订；王锐负责文章的质量控制及审校；刘超、王振彪进行文献检索、病例资料收集与整理、实验操作及结果分析。

本文无利益冲突。