三嗪类虚拟模板分子印迹聚合物的制备及其应用

巩碧钏，胡秋辉，苏安祥，徐 辉，刘建辉，裴 斐，杨文建*

（南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心，江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室，江苏 南京 210023）

我国是农业大国，每年的农药使用量约为30万 t[1]。三嗪类农药的分子结构式如图1所示，由于其除草活性高、价格低廉，被广泛应用于黄瓜、玉米、苹果等农作物生产中[2-3]。然而，三嗪类农药属水溶性农药，极易残留于果蔬当中，并且通过生物链的传递作用在人体内富集，对人体生殖系统、免疫系统、神经系统、内分泌系统造成极大损害[4-5]。

图1 三嗪类农药结构式Fig.1 Triazine pesticide structure

固相萃取是三嗪类农药样品最常用的预处理方法，但是传统的吸附剂稳定性差、重复率低，甚至会造成分析物和杂质化合物的共萃取，净化效果并不理想，严重制约了对目标农药的萃取效率、从而影响后期仪器分析结果[6-7]。因此，建立快速、精确、有效的食品中三嗪类农药残留的检测方法极为重要。

分子印迹技术是以特定的目标分子为模板分子，利用模板分子和功能单体之间通过分子间的共价作用力，非共价作用力合成具有三维空间结构的高分子聚合物，此三维结构的孔穴可以选择性地重新与模板分子结合，具有较强的分子识别能力[8-9]。分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymer，MIPs）作为新型固相萃取材料，对目标物具有高选择性的识别位点，而且制备简单、成本低，非常适合作为固相萃取柱的填料对痕量分析物进行富集[10-11]，可以改善传统食品安全检测方法存在的弊端[12]。

目前制备MIPs使用的模板多为分析物本身，然而，用分析物作为模板时，很难在洗脱过程中从聚合物中完全去除模板，分析物可能会在洗吸过程中渗出，即所谓的“模板泄漏”[13-14]。采用与目标物结构相似的物质作为虚拟模板，可以获得与目标物结构相似的吸附位点，也能避免不完全洗脱的目标物（即模板分子）对后续检测造成的影响。刘博等[15]用腈菌唑为模板分子，采用虚拟模板分子印迹固相萃取技术对食品中的联苯三唑醇与烯唑醇进行分离富集，该聚合物显示出在复杂的机制条件时，分离富集目标物的优越性能。陈静钰等[16]以烟酰胺作为吡虫啉和啶虫脒的结构类似物，制备虚拟模板MIPs，将其作为柱填充材料应用于茶多酚中，其对吡虫啉和啶虫脒去除率达到95%以上，为茶提取物中农药残留的脱除提供了一种新的思路和方法。Song Yiping等[17]合成了能同时识别8 种氟喹诺酮和8 种磺酰胺的双虚拟模板MIPs，该方法可用作检测肉类中的氟喹诺酮类和磺酰胺类药物残留，使用该MIPs制备的色谱柱可重复使用80 次以上。上述方法使用结构类似物作为合成MIPs的虚拟模板，可以有效解决“模板泄露”的问题，同时还保留了MIPs的高选择性与良好的吸附效果。

三嗪类农药的结构相似，主要区别在于三嗪环上的取代基不同，且与氨基取代基相连的烷基不同。Chen Jianlei等[18]通过计算机模拟模板与功能单体之间的作用力，发现与其他三嗪类化合物相比，灭蝇胺与功能单体间的结合能更高，表明灭蝇胺与单体复合物之间存在较稳定的相互作用力。本实验选择灭蝇胺作为虚拟模板，甲基丙烯酸（methacrylic acid，MAA）为功能单体，三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（trimethylolpropane triacrylate，TRIM）为三元交联剂，乙腈为致孔剂，采用本体聚合法制备三嗪类MIPs。对制备方法和萃取条件进行优化，建立三嗪类农药残留的检测方法并应用于苹果、黄瓜、玉米检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

标准样品（纯度）：扑草净（99%）、莠灭净（98.8%）；西草净（97%）、吡虫啉（98.5%）、灭蝇胺、阿特拉津（均为98%）、甲基丙烯酸（分析纯）、乙二醇二甲基丙烯酸酯（分析纯）、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（分析纯）、偶氮二异丁腈（分析纯） 美国Sigma公司；乙腈（色谱纯） 美国Tedia公司；三氯甲烷、甲醇、冰乙酸（均为分析纯） 阿拉丁试剂（上海）有限公司。

1.2 仪器与设备

Cary630傅里叶红外光谱仪 美国Thermo Fisher公司；1260高效液相色谱（high performance liquidchromatography，HPLC）仪 美国Agilent公司；DZF-6020真空干燥箱 常熟市中盛医用仪表有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 上海力辰邦西仪器科技有限公司；Allegra 64R离心机 美国Beckman Coulter公司；固相萃取装置 美国Supelco公司；SU8010扫描电镜 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 虚拟模板MIPs的制备与优化

将1 mmol灭蝇胺模板分子和4 mmol功能单体MAA溶于15 mL乙腈中，将混合物通过超声30 min进行预聚合，然后将交联剂4 mmol TRIM和30 mg偶氮二异丁腈添加到溶液中，超声处理5 min，充氮气5 min，在60 ℃的水浴锅中密闭反应24 h。将得到的块状聚合物研磨过200 目筛，用体积分数10%的乙酸-甲醇在索氏提取装置中洗脱12 h，洗去模板分子，直至用HPLC法检测不到提取液中模板分子的存在。将无模板分子的产物用甲醇和超纯水重复洗涤至少3 次，并在60 ℃真空干燥12 h。

1.3.2 虚拟模板非印迹聚合物的制备与优化

非印迹聚合物（non-imprinted polymers，NIPs）制备的第一步只需要加入4 mmol功能单体MAA溶于15 mL乙腈中，其余步骤与MIPs相同。

1.3.3 MIPs吸附性能

1.3.3.1 动力学吸附实验

称取MIPs和NIPs各10 mg，加入5 mL离心管中，选择扑草净作为三嗪类农药的代表农药，向离心管中加入80 mg/L的扑草净标准溶液混合均匀，25 ℃左右的室温将混合物在摇床上分别振荡不同的时间（15、30、60、90、120、150、180、210、240 min），然后将混合物25 ℃、8 000 r/min离心10 min，取上清液，过0.22 μm的滤膜，通过HPLC测定其浓度。根据式（1）计算MIPs、NIPs的吸附量：

式中：Q为达到平衡时聚合物对目标物的吸附量/（μg/g）；C0为扑草净的初始质量浓度/（mg/L）；C为扑草净的平衡质量浓度/（mg/L）；V为所加扑草净溶液的体积/mL；M为MIPs或NIPs的添加量/mg。

1.3.3.2 静态吸附实验及Scatchard模型

称取MIPs和NIPs各10 mg，加入5 mL离心管中，向离心管中加入不同质量浓度的1 mL扑草净标准溶液（25、50、75、100、125、150、175、200 mg/L），混合均匀，25 ℃左右的室温振荡2 h后25 ℃、8 000 r/min离心10 min，取上清液，通过HPLC测定其浓度。根据式（1）计算MIP、NIP的吸附量。

利用式（2）所示的Scatchard方程，绘制Scatchard曲线，并计算MIPs的结合常数Kd和最大表现吸附量Qmax[19]。

式中：Q为聚合物对扑草净的吸附量/（μg/g）；C为扑草净的平衡质量浓度/（mg/L）；Qmax为吸附位点的最大表观结合量/（μg/g）；Kd为吸附位点的解离平衡常数/（μg/L）。

1.3.3.3 选择性吸附

为了考察MIPs的特异性吸附能力，用MIPs对灭蝇胺、扑草净、阿特拉津、莠灭净、西草净以及吡虫啉的吸附性能进行了测试[20]。

1.3.4 4种三嗪类农药液相色谱条件

色谱柱为C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（7∶3，V/V）；流速为0.8 mL/min，柱温30 ℃，进样量为10 μL。

1.3.5 分子印迹固相萃取柱的制备及优化

采用干法装柱的操作：取1 根3 mL的固相萃取柱，用玻璃棒将孔径为20 μm的小筛板放入底部，称取30 mg的MIPs，作为填料装入固相萃取柱中，在填料上方放入1 块筛板压实填料，制成分子印迹固相萃取柱（molecularly imprinted solid phase extraction column，MISPE）。以扑草净作为三嗪类农药的代表，考察不同洗脱液条件的MISPE对扑草净的提取能力。

活化：3 mL乙腈中加入3 mL水；上样：1 mL的4 种三嗪类农药混合溶液；淋洗：3 mL体积分数为20%的乙腈水溶液；洗脱：3 mL醋酸：甲醇溶液（1∶9，V/V）。洗脱液氮气吹干后，乙腈复溶至1 mL。

1.3.6 方法学评价

分别称取5 g加入4 种三嗪类农药的黄瓜（苹果、玉米）样品，切碎后置于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈，旋涡振荡1 min，25 ℃、5 000 r/min离心10 min，过滤，合并上清液后，再过滤1 次。取1 mL上清液，氮气吹干，用1 mL乙腈水溶液复溶。参照MISPE法优化，根据HPLC检测洗脱液。

1.4 数据处理

每组数据重复3 次，采用Origin 9软件进行数据处理和作图，数据以3 次独立样品测定结果±s表示。

2 结果与分析

2.1 模板分子、功能单体和交联剂最佳比例的选择

合成MIPs时，功能单体、交联剂和致孔剂的种类及其比例对聚合物的吸附能力有很大影响[21]。选取灭蝇胺作为虚拟模板，选择常用的二元交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯（ethylene glycol dimethacrylate，EGDMA）和三元交联剂TRIM，并对其比例进行优化。致孔剂的选择会影响聚合物的形态和分子之间的键合强度[22-23]，分别选择乙腈和三氯甲烷作为致孔剂，合成一系列的聚合物。选择扑草净作为三嗪类农药的代表，通过聚合物对扑草净吸附量的大小，确定最佳聚合体系。如表1所示，尽管NIPs具有一定的吸附能力，所有的MIPs吸附能力均大于NIPs。当交联剂和致孔剂为TRIM和乙腈，模板分子灭蝇胺、功能单体MAA、交联剂TRIM的物质的量比为1∶4∶4为最佳聚合体系，此时聚合物对扑草净的吸附量达到1 467 μg/g。这是因为相比于EGDMA，TRIM作为三元交联剂极容易在聚合物中形成高聚合度的交联、网状三维结构，极大地增加了聚合物对扑草净的吸附量[24]。用乙腈作致孔剂时，对扑草净的吸附能力要比以三氯甲烷作致孔剂的MIPs高，而且MIPs更容易洗脱，所以选择乙腈作为致孔剂。

表1 聚合体系的设计和优化Table 1Design and optimization of polymerization system

2.2 MIPs和NIPs的形态结构表征

2.2.1 红外图谱分析

红外吸收带的波长的变化可以分析MIPs内印迹分子与功能单体结合过程中基团的变化及结合位点的位置[25]。如图2所示，NIPs具有O—H（3 446 cm－1）、C＝O（1 733 cm－1）、O—H（1 455 cm－1）、C—O—C（1 155 cm－1）的特征峰，这说明了本体聚合反应成功。与NIPs相比，MIPs在3 446 cm－1的特征峰强度高于NIPs，这是因为在NIPs中，O—H与C＝O生成氢键。而在MIPs中，O—H分别与C＝O和灭蝇胺印迹分子形成氢键，在灭蝇胺分子洗脱后，与灭蝇胺印迹分子形成氢键的C＝O又恢复到游离态，使O—H的特征峰强度更高[26]。

图2 MIPs、NIPs和灭蝇胺的红外光谱图Fig.2 Infrared spectra of MIPs, NIPs and cyromazine

2.2.2 MIPs的扫描电镜分析

MIPs和NIPs的分散情况及排列等表面形貌可以根据扫描电镜观察[27]。如图3A所示，30 000 倍的放大倍数下，MIPs呈现出单体结合成团状聚合物的状态，单个粒子呈现微球状，直径小，使得MIPs表面印迹位点较多。而图3B中，NIPs表面空穴较少，导致相应的吸附能力降低。

图3 MIPs（A）和NIPs（B）的扫描电镜结果（×30 000）Fig.3 Scanning electron micrographs of MIPs (A) and NIPs (B) (× 30 000)

2.3 MIPs和NIPs的吸附性能

2.3.1 静态吸附实验及Scatchard模型

图4A展示了静态吸附实验测定的MIPs和NIPs对不同质量浓度扑草净的等温吸附曲线。随着扑草净质量浓度的增加，MIPs和NIPs对扑草净的平衡吸附容量也随之增加，并且在相同质量浓度MIPs的平衡吸附容量远高于NIPs。这说明在MIPs中形成了与扑草净结构相匹配的特异性结构孔穴，所以对其亲和性高，因此对其的特异性吸附能力强。

如图4B所示，通过Origin软件进行拟合，得到2 个线性拟合方程：y=－0.018 68x+30.205 39（R2=0.987 02）和y=－0.006 37x+19.989 82（R2=0.922 04）。Scatchard方程能够客观地评价MIPs的结合特性[28]，Scatchard方程中有2 个线性相关的部分，说明MIPs对模板分子主要存在2 类吸附位点，其中y=－0.018 68x+30.205 39的Qmax（截距）和Kd（斜率绝对值的倒数）为1.6 mg/g和53.53 mg/L，y=－0.006 37x+19.989 82的Qmax和Kd为3.13 mg/g和156.99 mg/L。

图4 MIPs和NIPs的静态吸附实验（A）及MIPs Scatchard模型（B）分析Fig.4 Isothermal adsorption curves of prometryn onto MIPs and NIPs (A)and MIPs Scatchard model analysis (B)

2.3.2 吸附动力学及选择性吸附

采用吸附动力学实验探究MIPs及NIPs对扑草净的动态吸附规律[29]，如图5A所示，在前60 min，MIPs和NIPs对扑草净的吸附速度很快；在60 min之后，MIPs和NIPs基本均达到吸附平衡状态，吸附速度均下降。与NIPs相比，MIPs具有更快的吸附速度，并且达到吸附平衡状态时的吸附容量也更高，因为在吸附初期，MIPs表面存在更多的印迹点，能够更快地吸附目标物。而NIPs表面没有供目标物结合的印迹点，其吸附容量远低于MIPs。

图5 MIPs和NIPs的吸附动力学（A）和选择性吸附图（B）Fig.5 Adsorption kinetics (A) and selective adsorption (B) of MIPs and NIPs

MIPs和NIPs对6 种农药的选择性吸附结果（图5B）可以看出：MIPs对5 种三嗪类农药具有良好的选择性，其中，MIPs对灭蝇胺的吸附量最高，为1 131.35 μg/g，表明MIPs能够较好地记住模板化合物的结构，并能通过键合的方式识别模板结构相同或者相似的化合物。MIPs和NIPs对作为三嗪类农药中的含氮结构类似物，即吡虫啉的吸附量差别不大，说明制备的MIPs对5 种三嗪类农药具有良好的选择性。

2.4 固相萃取条件的优化

2.4.1 固相萃取淋洗条件的优化

对比不同淋洗液的洗脱效果，其固相萃取加标回收率实验结果见图6。结果表明，甲醇和二氯甲烷的使用均会不同程度地将目标物质洗脱下来，因为甲醇和二氯甲烷会破坏模板分子与印迹聚合物之间的作用力。使用体积分数为20%的乙腈溶液作为淋洗溶液，可以消除干扰物质而且不会将待测物质洗脱下来。

图6 不同淋洗液对固相萃取回收率的影响Fig.6 Effects of different washing solvents on the recovery of solid phase extraction

2.4.2 固相萃取洗脱条件的优化

对比乙腈、甲醇、体积分数为10%的醋酸-乙腈、体积分数为10%的醋酸-甲醇的洗脱效果，其固相萃取加标回收率的实验结果见图7。与仅用乙腈和仅用甲醇的洗脱组相比，体积分数为10%的醋酸-乙腈和体积分数为10%的醋酸-甲醇共2 个洗脱组对扑草净的回收效率更高。体积分数为10%的醋酸-甲醇和体积分数为10%的醋酸-乙腈的回收率提高了约20%，其中体积分数为10%的醋酸-甲醇回收率达到93.1%，因为醋酸能够降低洗脱液的pH值，阻止pH值达到农药和MIPs结合的最理想pH值，从而降低农药分子与分子印迹孔穴的结合概率。因此增加了洗脱效率，提高了MIPs对目标农药的回收率[30]。并且，甲醇没有参与MIPs的制备，也不会与印迹模板形成氢键构象，所以甲醇的吸附能力比乙腈弱，因而选择体积分数为10%的醋酸-甲醇作为洗脱液。

图7 不同洗脱液对固相萃取回收率的影响Fig.7 Effects of different eluents on the recovery of solid phase extraction

2.5 方法学评价

2.5.1 线性范围与检出限

根据信噪比为3计算方法的检出限[31]，结果见表2。4 种三嗪类农药标准曲线的相关性系数均在0.99以上，线性范围均在0.05～1.00 µg/mL。阿特拉津和西草净的检出限均为0.03 ng/mL，扑草净和莠灭净的检出限均为0.01 ng/mL。

表2 4 种三嗪类农药线性关系与检出限Table 2Linear relationships and detection limits of four triazine pesticides

2.5.2 黄瓜中4 种农药的检测结果

根据优化的条件对黄瓜中的4 种加标农药（0.1 μg/mL）进行检测，结果如图8所示，未经任何处理的黄瓜提取液在2～4 min会出现面积较大的不规则杂峰，此现象可能是由于黄瓜本身含有色素[32]，从而严重影响了仪器的灵敏度，导致4 种农药的回收率降低。采用市场中最普遍的C18固相萃取柱测定4 种农药，一定程度地净化了杂质峰，平均回收率为87.6%。相比于C18固相萃取柱，采用MIPs所制备的MISPE柱大大降低了黄瓜提取物中杂质峰的干扰，其对目标农药的平均回收率最高可达98.9%。

图8 加标黄瓜样品色谱图Fig.8 Extracted ion chromatograms of spiked cucumber samples

2.5.3 样品回收率和精密度实验

为了进一步验证MIPs所制备的MISPE柱对食品中三嗪类农药的检测效果，分别对黄瓜、苹果和玉米中4 种农药的平均回收率和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）进行测定。如表3所示，在0.10、0.25、0.50 μg/mL加标水平，黄瓜中4 种农药的平均回收率在84.2%～98.1%，RSD在2.2%～4.2%之间；苹果中4 种农药的平均回收率在89.8%～104.3%，RSD在2.4%～4.3%之间；玉米中4 种农药的平均回收率在81.5%～97.2%，RSD在1.3%～5.8%之间。综上，本实验制备的MISPE柱在黄瓜、苹果和玉米的回收率均大于81.5%，净化效果好，说明该方法可以用于苹果、黄瓜、玉米中三嗪类农药的残留检测。

表3 回收率和精密度实验（n=3）Table 3 Spiked recoveries and precision (n=3)

3 结 论

采用本体聚合法制备了虚拟模板MIPs，并优化了制备条件，当灭蝇胺、MAA、TRIM物质的量比为1∶4∶4，加入15 mL乙腈，聚合物的吸附效果最好，以该聚合物作为固相萃取柱的填料，制备MISPE，用于样品前处理，建立了检测食品中阿特拉津、扑草净、莠灭净、西草净共4 种三嗪类农药的分子印迹固相萃取-HPLC的方法，对苹果、玉米、黄瓜样品做加标回收实验，平均回收率在81.5%～104.3%之间，RSD为1.3%～5.8%，基本满足农药残留分析方法。本实验提高了检测效率与精确度，为建立三嗪类农药残留的检测方法提供参考。