乙醚萃取法分析郫县豆瓣酱重要香气成分

赵 聪，范文来*，徐 岩

（教育部工业生物技术重点实验室，江南大学生物工程学院，江苏 无锡 214122）

酱具有独特的色、香、味、形，是人们日常生活中不可或缺的调味品[1]。酱通常以黄豆、蚕豆、面粉、辣椒为主要原料，通过微生物发酵而成，富含多种风味物质。郫县豆瓣酱是我国一种独特的发酵调味酱，别称蚕豆酱、豆瓣辣酱或蚕豆辣酱，是烹饪川菜必不可少的调味品[2]。郫县豆瓣酱是以蚕豆、辣椒、面粉和盐为原料，其生产过程包括辣椒到辣椒醅发酵、蚕豆到蚕豆饼曲发酵及辣椒醅与蚕豆饼曲混合发酵3 个阶段；其他发酵调味酱的原料主要是大豆、面粉和盐，其生产过程包括制曲和加盐水发酵晾晒2 个阶段[3-4]。由于原料与工艺的差别，郫县豆瓣酱与其他豆瓣酱相比更具鲜辣香醇、红润光艳、黏稠绒实、酱香浓郁的产品特色，深受广大消费者的喜爱。

酱的风味是衡量酱品质的重要指标之一。近年来，随着风味研究技术的应用，对发酵调味酱的风味研究日益深入。赵建新等[5]采用顶空-固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）结合气相色谱-闻香（gas chromatography-olfactometry，GC-O）分析传统酱的香气活性物质；Zhao Jianxin等[6]采用HS-SPME结合香气稀释萃取（aroma extraction dilution，AED）分析自然发酵与接种发酵酱的香气物质；Zhang Yan等[7]采用同时蒸馏萃取（simultaneous distillation extraction，SDE）结合AED分析酱的香气物质；刘平等[8]采用SDE结合香气活性值法表征郫县豆瓣酱的特征香气；Lin Hongbin等[9]采用水溶萃取提取酱的香气物质。上述研究主要集中于香气物质的提取与鉴定，这些方法能否最大程度提取酱的特征香气物质，并没有验证，因此在香气特征方面难以建立工业标准。

本研究分别采用水、乙醚和二氯甲烷萃取豆瓣酱的香气化合物，通过比较萃取液气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）图谱峰的数量和丰度结合感官品评结果，选择最适的香气提取方法；并将萃取液分酸-水溶性组分和中-碱性组分，结合GC-O和GC-MS技术对郫县豆瓣酱的香气贡献进行解析，确定郫县豆瓣酱的重要香气化合物。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

郫县豆瓣酱由四川省郫县豆瓣股份有限公司提供。

无水乙醚、Na2SO4、NaCl、H2SO4、NaHCO3（均为分析纯） 中国医药（集团）上海化学试剂公司；二氯甲烷和标准品（均为色谱纯） 美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

GC 6890N-MSD 5975型GC-MS联用仪 美国Agilent公司；Gerstel ODP2闻香装置 德国Gerstel公司；N-EVAP111型氮吹仪 美国Organomation公司；DB-FFAP色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm） 上海安谱科学仪器有限公司；Mili-Q超纯水仪 美国Millipore公司；SB-5200D超声波清洗仪 天津Autosciennce公司；VL-3000A搅拌机 中山市小榄镇威的电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品均质化与浸提

将豆瓣酱样品置于搅拌机搅拌粉碎后，分别称取100 g粉碎的样品于离心管中，分别加入200 mL煮沸冷却的超纯水、重蒸无水乙醚和重蒸二氯甲烷，密封、涡振2 min后，20 ℃超声20 min；4 ℃、10 000 r/min离心5 min，收集上清液，乙醚萃取液记为“萃取相I”。

1.3.2 萃取相分馏

由于酱体系较为复杂，为了避免GC-MS分析时分离不佳和便于GC-O分析，需将萃取相按pH值分成酸-水溶性和中-碱性组分，便于香气物质的分离和鉴定。参考Qian等[10]报道的香气物质提取方法，在“萃取相I”中加入100 mL煮沸冷却的超纯水与适量NaCl饱和，用10% NaHCO3溶液调pH值至9.0，静置分层，收集水相，用20 mL超纯水洗涤有机相2 次，水洗液与水相合并，记为“萃取相II”，有机相记为“萃取相III”，“萃取相III”即为中-碱性组分。“萃取相II”加无水NaCl饱和，用2 mol/L H2SO4溶液调pH值至2.0，用60 mL重蒸乙醚萃取3 次，合并有机相，记为“萃取相IV”，即为酸-水溶性组分。在“萃取相III”与“萃取相IV”中加无水Na2SO4置于－20 ℃冰箱中干燥过夜，分别浓缩至250 µL，用于GC-O和GC-MS分析。

1.3.3 描述性分析

感官培训参考文献[11]进行。感官品评小组由从事风味研究的10 名研究生组成（6 男4 女），品评员定期参加感官培训（每周至少1 次，持续半年），所有感官训练均在20 ℃的感官品评室中进行。品评人员分别对豆瓣酱原样、乙醚萃取液、水萃取液及二氯甲烷萃取液进行感官评定，共产生6 个典型香气属性表征样品的感官特性。品评人员对每个属性的评分范围为0～5，5为最高强度，0为最低强度，每个样品的每个属性最终得分为10 次品评的平均分。

1.3.4 GC-O分析

参考Xu Yan等[12]的时间强度法，挑选2 名经过闻香训练的硕士研究生进行GC-O分析，同时记录保留时间、香气特征和香气强度。香气强度采用0～5共6 个等级，“0”表示未闻到香气，“3”表示香气中等，“5”表示香气非常强。每个组分每人闻3 次，每个化合物的香气强度为6 次闻香强度的平均值。

1.3.5 GC-MS分析

GC条件：色谱柱为DB-FFAP（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样口温度250 ℃；载气为He；流速2 mL/min；进样量1 µL；不分流进样；升温程序：50 ℃保持2 min，以6 ℃/min升温至230 ℃，并保持15 min。

MS条件：电子电离源；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；质量扫描范围35～350 u。

1.3.6 定性分析

未知香气化合物的保留指数（retention index，RI）根据改进的Kovats法计算得到[13]。化合物质谱与NIST 05 a.L数据库中标准谱图比对，定性结果将化合物RI、香气描述与标准品的RI和香气描述比对确认。

2 结果与分析

2.1 香气化合物提取剂的选择

如图1所示，乙醚萃取液挥发性化合物总离子流图（图1a）的峰数量最多，且化合物的丰度最高；水萃取液挥发性化合物总离子流图（图1b）的峰数量最少，化合物的丰度次之。

图1 乙醚萃取液（a）、水萃取液（b）和二氯甲烷萃取液（c）挥发性化合物总离子流图Fig.1 Total ion current chromatograms of volatile compounds present in ether extract (a), water extract (b), and dichloromethane extract (c)

如图2所示，确定6 个典型香气属性（酱香、糟香、焦糖香、烘焙香、烟熏、香辛料）表征样品的感官特性。水萃取液香气轮廓与原酱样香气轮廓差异明显，酱香、香辛料与原酱样差异较大。乙醚萃取液香气轮廓与原酱样香气轮廓差异最小，6 个香气属性都比较接近。二氯甲烷萃取液香气轮廓与原酱样香气轮廓差异也较小，但酱香与烘焙香较乙醚提取差，萃取效果没有乙醚好。

图2 原豆瓣酱样品与3 种萃取液香气轮廓图Fig.2 Aroma profiles of Pixian bean paste and three extracts from it

综上，经GC-MS分析与感官品评结果表明，乙醚萃取液GC-MS图谱峰的数量最多且丰度最高，乙醚萃取液与原酱样的整体香气轮廓最接近，因此选择乙醚作为豆瓣酱香气物质的提取剂。

2.2 GC-O分析结果

通过GC-O闻香共鉴定到46 种香气物质，其中醇类5 种、挥发性有机酸类13 种、醛酮类7 种、酚类11 种、芳香族类5 种、杂环类3 种以及吡嗪类2 种。

2.2.1 酸-水溶性组分

如表1所示，在酸-水溶性组分中共鉴定到33 种香气化合物，主要为挥发性有机酸类、酚类、醛酮类、芳香族和杂环类。

表1 郫县豆瓣酱酸-水溶性组分香气化合物的闻香结果Table 1 Aroma intensities of acid-water soluble aroma compounds from Pixian bean paste

挥发性有机酸类13 种，挥发性有机酸的存在反映了郫县豆瓣酱具有酸味、腐臭、奶酪的香气特征。根据香气强度值，乙酸、3-甲基丁酸、3-甲基戊酸和4-甲基戊酸是重要的酸类物质。乙酸（香气强度4.2）香气贡献较大，是郫县豆瓣酱最重要的酸类物质，贡献醋酸气味。其次是3-甲基丁酸（香气强度3.7）、3-甲基戊酸（香气强度3.8）与4-甲基戊酸（香气强度3.7）是郫县豆瓣酱重要的酸类物质，贡献腐臭、奶酪、汗臭气味。在日本味噌中鉴定到香气贡献较大的酸类物质有乙酸与3-甲基丁酸[19]。在韩国大酱中发现挥发性有机酸贡献大小顺序为丙酸、4-甲基戊酸、3-甲基戊酸、乙酸、3-甲基丁酸[20]，而郫县豆瓣酱中乙酸的贡献相对于3-甲基丁酸对酱的风味贡献更大。巴豆酸之前并未报道过，为首次鉴定，呈奶酪香气。在发酵食品中，酸类物质一般由细菌产生[21]。

酚类物质8 种，反映郫县豆瓣酱典型的烟熏、香辛料香气特征。根据香气强度值，苯酚、2,6-二甲氧基苯酚、4-乙烯基愈创木酚、愈创木酚、4-甲基愈创木酚是重要的酚类物质。苯酚（香气强度3.7）、2,6-二甲氧基苯酚（香气强度3.5）、4-乙烯基愈创木酚（香气强度3.4）是郫县豆瓣酱最重要的酚类物质，分别贡献药香、香辛料、烟熏气味，其中2,6-二甲氧基苯酚为首次鉴定。愈创木酚（香气强度3.3）和4-甲基愈创木酚（香气强度3.2）是郫县豆瓣酱重要的酚类物质，贡献烟熏、香草气味。苯酚与愈创木酚是国内酱重要的香气组成[6]。愈创木酚、4-乙烯基愈创木酚与4-乙基苯酚对日本味噌与韩国大酱的香气贡献较大[19,22]。苯酚、愈创木酚主要由一些细菌降解氨基酸生成[23]。

醛酮类物质5 种，特别是呋喃酮类化合物使郫县豆瓣酱具有典型的焦糖香气特征。醛酮类化合物一般由氨基酸脱氨脱羧、酮酸脱羧、醇氧化等化学反应生成[24]。2,5-二甲基-4-羟基-3(2H)-呋喃酮（香气强度3.7）是一种重要的呋喃酮类化合物，呈焦糖香气，曾有报道其是鲁氏酵母的次级代谢产物[25]。2,5-二甲基-4-羟基-3(2H)-呋喃酮已经在日本味噌中发现，是日本味噌中一种重要的香气物质[19]。首次在豆瓣酱中发现3,4-二甲基-2,5-呋喃二酮与3-甲基-1,2-环戊二酮，均呈焦糖香气。

在酸-水溶性组分共鉴定到4 种芳香族化合物，反映郫县豆瓣酱典型的花香香气特征，其中2-苯乙醇（香气强度3.6）与2-苯乙酸（香气强度3.2）是郫县豆瓣酱重要的芳香族化合物，贡献玫瑰花香与甜香。在酸-水溶性组分鉴定到2-乙酰基吡咯1 种杂环类化合物，呈甜香，该化合物已经在日本味噌中发现[22]。

2.2.2 中-碱性组分

如表2所示，在郫县豆瓣酱的中-碱性组分共鉴定到20 种香气化合物，主要是醇类、酚类、醛酮类、吡嗪类、杂环类和芳香族化合物。根据香气强度值，1-辛烯-3-酮、2-乙基-6-甲基吡嗪、3-甲硫基丙醛、2-糠醇、苯乙醇和丁子香酚是郫县豆瓣酱重要的香气化合物。

表2 郫县豆瓣酱中-碱性组分香气化合物的闻香结果Table 2 Aroma intensities of neutral-alkaline aroma components from Pixian bean paste

在中-碱性组分鉴定到5 种醇类，反映郫县豆瓣酱果香和甜香的香气特征。2-糠醇（香气强度3.5）是最重要的醇类物质，呈焦糖香气。在酸-水溶性与中-碱性组分均能检测到3-甲硫基丙醇与2-甲基丙醇，分别呈土豆与指甲油气味。相关研究认为醇类化合物主要来源于氨基酸[28]。

共鉴定到5 种酚类，主要呈烟熏和药香。在酸-水溶性组分与中-碱性组分均能检测到愈创木酚、苯酚与4-乙基苯酚。丁子香酚（香气强度3.5）是最重要的酚类物质，呈酚臭、丁香气味。

在中-碱性组分中鉴定到3 种醛酮类。国内外相关研究表明[6,19,22]，1-辛烯-3-酮（香气强度3.6）具有较强的风味贡献，呈蘑菇气味，与本研究结果一致。糠醛呈甜香、杏仁香气，对国内酱的风味贡献较大[6]。在豆瓣酱中鉴定到2 种吡嗪，反映郫县豆瓣酱典型的烘焙、坚果香气特征。2,6-二甲基吡嗪呈坚果、焙烤香气，2-乙基-6-甲基吡嗪呈烤榛子香气。吡嗪类化合物主要来源于微生物代谢或美拉德反应生成[29-30]。本研究首次鉴定到γ-丁内酯，呈焦糖香气。在2 个组分中均能检测到苯甲醇与2-苯乙醇，3,4-二甲基苯甲醛为首次鉴定，呈杏仁香气。

3 结 论

本实验采用水、乙醚和二氯甲烷3 种溶剂萃取豆瓣酱的香气物质，从萃取液GC-MS图谱峰的数量和丰度以及感官品评结果看，乙醚为最合适的香气物质提取剂。将乙醚萃取液按酸碱性分离，然后联用GC-O和GC-MS技术，全面解析豆瓣酱的香气化合物。在郫县豆瓣酱中鉴定到46 种香气化合物，其中香气强度较大的物质有乙酸、3-甲基丁酸、3-甲基戊酸、2-苯乙醇、2,5-二甲基-4-羟基-3(2H)-呋喃酮、苯酚、1-辛烯-3-酮、2-糠醇和丁子香酚，这些化合物是郫县豆瓣酱重要的香气物质。首次在郫县豆瓣酱中鉴定到3,4-二甲基-2,5-呋喃二酮、巴豆酸、2,6-二甲氧基苯酚、3-甲基-1,2-环戊二酮、γ-丁内酯和3,4-二甲基苯甲醛6 个香气化合物。本研究首次采用乙醚直接萃取酱的香气物质，并首次按酸碱性分离酱的香气物质，确定了郫县豆瓣酱重要的香气化合物，对进一步改进郫县豆瓣酱的生产工艺、揭示郫县豆瓣酱的发酵机理具有重要指导意义。