蛋白精氨酸甲基转移酶5抑制剂研究进展

詹康宁，全 旭，黄张建，赵立文*

（1中国药科大学新药研究中心，南京210009；2南京圣和药业股份有限公司，南京210038）

蛋白质精氨酸甲基转移酶（protein arginine methyltransferase，PRMT）催化的精氨酸胍基甲基化，是一种常见的真核生物细胞翻译后修饰，影响细胞信号传导、基因转录、mRNA翻译、DNA重组和修复等多种生物学过程［1-4］。作为PRMT家族的成员，PRMT5介导的甲基化在维持正常细胞内环境平衡中发挥重要作用。然而，越来越多的研究表明，PRMT5的异常表达与多种肿瘤发生相关，目前已被认定为抗肿瘤药物研发的重要靶点［5］。本文介绍了PRMT5的结构、生化功能及其与肿瘤的相关性，对目前在研的PRMT5抑制剂进行综述，并讨论了PRMT5抑制剂的未来发展方向。

1 PRMT家族

PRMTs甲基化特定精氨酸胍基氮原子，由S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）提供甲基，同时释放出一个分子的S-腺苷-L-同型半胱氨酸（S-adenosyl-L-homocysteine，SAH）。根据修饰形式，将PRMTs分成3类（图1）：第1类（PRMT1、2、3、4、6、8）催化形成ω-NG-单甲基精氨酸（monomethyl⁃arginines，MMA）和ω-NG，NG-不对称二甲基精氨酸（asymmetric dimethylarginines，aDMA）；第2类（PRMT5、9）催化形成ω-NG-MMA和ω-NG，N'G对称二甲基精氨酸（symmetric dimethylarginines，sD⁃MA）；第3类（PRMT7）只催化ω-NG-MMA的形成［6］。PRMT1和PRMT5分别是主要的aDMA和sDMA形成酶，两者相较于其他PRMTs底物更多，目前研究表明在多种肿瘤中PRMT5表达水平升高［5］。

图1 3种PRMTs催化精氨酸甲基化反应

2 PRMT5的结构特征

PRMT5是细胞中主要的sDMA形成酶，N端为TIM桶状结构蛋白（TIMbarrel），C端是甲基转移结构域（图2）［7-8］。TIMbarrel与甲基转移酶复合体蛋白50（methylosome protein 50，MEP50）结合形成活性更高的复合体［9］。甲基转移结构域由底物结合位点和SAM结合位点组成，这两个结合位点通过一条狭窄的疏水通道（由Leu312、Phe327和Trp579形成）相连，使底物和SAM接近。活性部位有两个高度保守的谷氨酸残基（E435和E444）形成双E环。每个谷氨酸残基与底物精氨酸的胍基形成一对盐桥，从而允许甲基从SAM通过SN2过渡态转移到精氨酸残基上［10］。

图2 PRMT5:MEP50复合体的总体结构(PDB：4GQB)(A)和放大的H4R3底物肽结合槽(B)[11]

在一项对线虫PRMT5的突变研究中，将底物口袋中的保守残基之一Phe379变为蛋氨酸，可以实现H4R3同时进行sDMA和aDMA［7］。同样的，当人PRMT5中相应位置的Phe327突变也相应导致aDMA活性增强［7］。Phe327是PRMT5特有的残基，与sDMA功能密切相关，这可能是设计PRMT5特异性抑制剂时要考虑的一个重要因素。

3 PRMT5的生化功能

PRMT5广泛存在于细胞核和胞浆中，通过调控组蛋白及多种非组蛋白的甲基化修饰影响各种细胞过程。

PRMT5通过许多核质底物的甲基化起作用，包括组蛋白H2A、H3和H4［12］，Sm蛋白［13］，RAF蛋白［14］等等。组蛋白精氨酸sDMA被认为是一种阻遏标记，调节基因转录［12］。也有证据表明PRMT5通过Sm蛋白甲基化参与调节哺乳动物正确的mRNA结构性剪接［15］。PRMT5通过RAF蛋白甲基化调控RAS-RAF-MEK-ERK信号通路［14］。

部分非组蛋白也被鉴定为PRMT5的底物，在细胞功能调控中发挥重要作用［16-18］。例如，在DNA损伤时，PRMT5甲基化肿瘤抑制因子p53的3个精氨酸（Arg333，Arg335，Arg337），改变了p53与DNA的结合活性，进而触发p53控制的基因表达程序改变［17］。此外，PRMT5可甲基化转录因子E2F-1和NF-κB的P65，从而诱导目标基因的表达［19-20］。并且PRMT5也可与其他细胞蛋白结合，如高尔基体蛋白GM130、核糖体蛋白S10，分为维持高尔基体结构和核糖体正确组装［21-22］。

4 PRMT5与肿瘤的关系

最近几年，作为一个抗肿瘤药物靶点，PRMT5越来越引起科学界的关注。它在多种肿瘤中过表达，包括胶质母细胞瘤、肺癌、前列腺癌等，并在不同肿瘤中发生机制不同［5］。

例如，在临床上越来越多人胶质母细胞瘤病例的发生与PRMT5过表达相关［23］。研究发现，定位于肿瘤细胞胞浆的长非编码RNA，LINC00515与SNHG16，分别通过miR-16与miR-4518调节PRMT5高表达，招募并限制肿瘤抑制基因ST7与PTEN的表达，导致肿瘤发生［24-25］。相同的，PRMT5在人肺癌组织中显示高表达，在组织培养中，下调PRMT5的表达和使用PRMT5选择性抑制剂可明显抑制肺癌A549和H1299细胞的增殖。研究显示PRMT5是蛋白激酶B的上游调节因子，直接与蛋白激酶B共定位并相互作用，从而诱导肺癌细胞增殖［26］。在前列腺癌中，PRMT5通过表观基因激活前列腺癌细胞中雄激素受体（androgen receptor，AR）的转录来促进前列腺癌细胞的生长［27］。免疫共沉淀结果显示PRMT5与负责AR转录的主要转录因子Sp1、ATP依赖的染色质重塑剂BRG相互作用，诱导AR基因启动子区域的H4R3对称甲基化，激活并促进细胞生长。因此敲减PRMT5或用特定的PRMT5抑制剂会减少AR的表达，从而抑制AR阳性（而非阴性）的前列腺癌细胞生长［18］。

此外，由于代谢酶5-甲硫腺苷磷酸化酶（5'-methylthioadenonine phosphorylase，MTAP）基因与人类染色体9p21上的抑癌基因CDKN2A非常接近，因此在CDKN2A基因缺失的肿瘤中经常伴随MTAP缺失，是肿瘤中突变频率最高的基因之一。MTAP缺失使其底物甲硫腺苷（methylthio⁃adenosine，MTA）积累，MTA能选择性抑制PRMT5甲基转移酶的活性，并使其对进一步的PRMT5抑制更为敏感［28］。这表明PRMT5抑制剂可以成为MTAP缺失或低表达肿瘤患者的一种高度选择性的治疗方法。

5 新型PRMT5抑制剂

近年来，PRMT5作为肿瘤治疗的潜在靶点受到特别关注［11，16，29-34］。目前已有大量PRMT5小分子抑制剂报道，根据化合物是否占据SAM结合位点，可将其分为两类，SAM非竞争性抑制剂和SAM竞争性抑制剂，其中SAM非竞争抑制剂占据底物结合位点与底物竞争，而SAM竞争抑制剂则是占据SAM的结合位点。

5.1 SAM非竞争性抑制剂

5.1.1 EPZ015666 EPZ015666是第一个报道的具有细胞增殖抑制活性且可口服的PRMT5抑制剂，其IC50为22 nmol/L［35］。在一组5种髓细胞白血病（myeloid cell leukemia，MCL）细 胞 系（Z-138，Maver-1，Mino，Granta-519和Jeko-1）中，EPZ015666以浓度依赖的方式降低了SmD3甲基化水平和细胞增殖效应，在PRMT5基因敲除细胞中也观察到同样的SmD3降低。利用细胞热位移分析进一步确认EPZ015666与细胞内的PRMT5特异性结合。该化合物在小鼠体内表现出良好的药代动力学特性，静脉给药2 mg/kg后，AUC0-t为1 110 h·ng/mL，t1/2为1.38 h，分布体积为1.67 L/kg，血浆清除率为30 mL/（kg·min）。小鼠经口给予10 mg/kg，cmax为3 500 ng/mL，AUC0-t为3 847 h·ng/mL，t1/2为1.62 h，生物利用度为69%［36］。在一项Z-138皮下异种移植肿瘤小鼠模型的21 d体内药效学研究试验中，经口给予EPZ015666（200 mg/kg，po，bid），肿瘤生长抑制率接近95%［36］。

PRMT5：MEP50-SAM-EPZ015666共晶结构显示（图3），在SAM存在下，EPZ015666结合在肽结合部位，提示它是与肽底物（Ki=5±0.3 nmol/L）而非辅因子SAM发生竞争。为了找到EPZ015666对PRMT5高选择性的原因，进一步对晶体结构分析，发现EPZ015666与许多残基相互作用，在sDMA过程中起重要作用。特别是四氢异喹啉（THIQ）结构在这个过程中发挥重要作用：（1）THIQ的苯环与SAM之间存在阳离子-π相互作用；（2）THIQ环与PRMT5特有的残基Phe327形成潜在的π-π堆积作用，其他PRMTs在该位置的残基是Met［7］；（3）THIQ位于由Leu319、Tyr324、Phe327和Trp579形成的疏水小口袋中，不利于极性官能团或体积大的基团；（4）THIQ的叔胺氮原子在水介导下与E435相互作用，影响整体催化过程。此外，EPZ015666的手性羟基和E444的侧链之间可能存在氢键相互作用，因此EPZ015666与之对应的立体异构体活性会有较大差异。EPZ015666的末端嘧啶基团也和Phe327、Phe580有π-π堆积作用。上述相互作用可能是EPZ015666对PRMT5的高亲和力和高选择性的原因［36］。

图3 EPZ015666与PRMT5:MEP50和SAM的共晶结构(PDB：4X61)[35]

5.1.2 GSK3326595 化合物GSK3326595保持了THIQ结构，PRMT5酶抑制活性IC50为6.2 nmol/L，该化合物分别通过调节人结肠癌细胞株SW480中p53与人套细胞淋巴瘤细胞株Z-138中p21的活性抑制SW480与Z-138增殖，诱导细胞周期阻滞。在Z-138皮下肿瘤异种移植小鼠模型中，GSK3326595有效抑制肿瘤体积（0.2～100 mg/kg，po，bid或50～200 mg/kg，po，qd）。同时该化合物呈现良好的药代动力学特性，静脉给药1 mg/kg后，AUC0-t为415 h·ng/mL，t1/2为1.42 h，分布体积为1.42 L/kg，血浆清除率为39 mL/（kg·min）。小鼠经口给予1 mg/kg，cmax为1 050 ng/mL，AUC0-t为3 450 h·ng/mL，t1/2为0.25 h，生物利用度为80.7%［37］。它具有良好的脑通透性和抗肿瘤效果，目前开展的两项Ⅰ期临床试验，用于评价其在治疗实体瘤、非霍奇金淋巴瘤（NCT02783300）和骨髓增生异常综合征、急性髓性白血病（NCT03614728）的安全性和临床疗效。

5.1.3 其他PRMT5非竞争性抑制剂 为了开发更有效的PRMT5抑制剂，研究人员将GSK3326595的2位侧链移至3位，得到了一系列活性化合物，如化合物1对PRMT5具有很高的抑制活性（IC50=26 nmol/L）［38］。在此基础上，默沙东公司利用环合策略获得了3，4-二氢-2，6-萘啶-1-酮类抑制剂，结果提示了手性羟基对PRMT5的氢键作用的重要性。经过分离得到了不同构型的小分子化合物2和化合物3，其中一个化合物的活性（IC50=10.84 nmol/L）明显强于另一个化合物（IC50=481.5 nmol/L）。有趣的是，在化合物2和化合物3的萘啶酮4位引入两个甲基得到了活性更高的化合物4（IC50=1.53 nmol/L）和化合物5（IC50=56.89 nmol/L），提示在这个位置可能还存在除了能够与Phe327和Phe580形成π-π堆积之外的其他的作用力，因此值得开展进一步的结构优化探索［39］。此外，阿古诺公司将THIQ替换成三环结构，得到一系列化合物，其中代表的化合物6与GSK3326595极为类似，PRMT5酶抑制活性IC50为10 nmol/L［40］。

此外，研究人员在EPZ015666的基础上发现了一种新型萘环抑制剂，经过优化后得到了DCC01（IC50=2.8μmol/L），它能够呈剂量依赖地抑制一些肿瘤细胞（Z-138、Maver-1和Jeko-1）增殖［41］。分子对接结果显示，DC-C01的2位上苯环类似于EPZ015666的末端嘧啶，可能与Phe327和Phe580形成π-π堆积，而1位侧链上的苯环则可能与SAM形成阳离子-π相互作用，并且有可能与Phe327产生π-π堆积［41］。

5.2 SAM竞争性抑制剂

5.2.1 A9145C PRMTs含有高度保守的辅因子SAM甲基转移结合域，而SAH和天然产物西奈芬净则是SAM的结构类似物，两者均显示出良好的PRMT5抑制活性，但对其他PRMTs缺乏选择性。A9145C是早期基于西奈芬净结构研发出的SAM竞争抑制剂，在与PRMT5：MEP50和H4组蛋白肽段的晶体结构中显示，A9145C可以和SAM结合域中的几个残基（如，Asp419、Met420、Glu392和Try324）互相作用，但是它产生相互作用的结构与SAM对应的结构一致，包括腺苷部分的主体与两个氢键、尾部的羧基，仅有C5氨基部分可能与组蛋白H4产生额外的相互作用，因此它虽然能很好地结合在SAM结合域中，但仍然缺乏对PRMT5的选择性［9］。

5.2.2 LLY-283 在后续的研究中，MTA被证明是一种有效的、选择性的PRMT5抑制剂［28］。这一发现提示模拟SAM结构的核苷类似物有望对PRMT5产生较好的选择性抑制活性。为此，2018年，发现了一种有效的选择性PRMT5抑制剂LLY-283，具有较强的PRMT5酶抑制活性，IC50为20 nmol/L［42］。LLY-283是SAM的类似物，其中苯基取代了SAM中的蛋氨酸部分，且与核糖的构象十分类似。除了与相同残基的相互作用外，LLY-283的苯基与PRMT5特有的残基Phe327形成π-π堆积［42］。此外研究发现，将吡咯嘧啶换成其他芳杂环基团时，酶抑制活性下降［43］。在体外细胞增殖抑制实验中，LLY-283对在许多血液瘤和实体肿瘤细胞系（HCC1937、NUGC3、MV4-11、NCI-HI1930、A375等20余种）中都观察到了强大的抗增殖作用。在人黑色素瘤A375肿瘤异种移植小鼠模型中，给药28 d，LLY-283（20 mg/kg，qd）显著抑制肿瘤生长［42］。该化合物具有良好的ADME性能，小鼠经口给予10 mg/kg，cmax为3 646 ng/mL，AUC0-t为7 943 h·ng/mL，t1/2为3.41 h，生 物 利 用 度 为50%［42］。

5.2.3 JNJ6461978 JNJ64619178是第一个进入临床试验的基于SAM结构的模拟核苷类似物（NCT03573310），采用环戊烷替代了SAM中的四氢呋喃环。它对PRMT5酶的抑制活性IC50为6.3 nmol/L，并对 一 组 肺 癌 细 胞（A549、NCI-H441、H1048、HCC78）表现良好的增殖抑制活性［44-45］。分子对接显示，喹啉环与Phe327形成π-π堆积，并且可能占据了组蛋白底物精氨酸的位置，而喹啉上的氨基则与双E环中的E444相互作用。这种相互作用方式表明，JNJ64619178对SAM和底物都有潜在的竞争性作用［34］。

5.2.4 其他SAM竞争性抑制剂 LLY-283和JNJ64619178的发现激发了更多研究者对SAM竞争性抑制剂的兴趣。鉴于PRMT5的活性位点附近有一个特有的半胱氨酸C449，人们推测其可作为潜在的共价修饰位点［34］。最近，Prelude公司报道一个醛类化合物7，它和PRMT5的相互作用与LLY-283类似，所不同的是，该化合物的醛基能额外地与C449巯基产生亲核加成反应，在生理pH条件下，形成的中间体会自动消除一分子水，从而形成乙烯基硫醚（图4）。该化合物显示良好的PRMT5选择性，IC50为19.5 nmol/L［46］。研发共价抑制剂不仅有利于提高对化合物的选择性，或许还有助于将来解决PRMT5抑制剂潜在的耐药性。

图4 乙烯基硫醚的形成过程

6 总结与展望

近年来，PRMT5抑制剂已成为抗肿瘤药物研发的热点，然而目前已报道的大多数抑制剂仍局限于类似的骨架结构。在不同肿瘤发生过程中，PRMT5导致肿瘤发生的机制各有不同且部分尚未明确，为了更好地了解PRMT5的治疗潜力，还需要挖掘更多关于PRMT5功能的生物学信息。

对于SAM非竞争性抑制剂，诺华公司和Agios公司对该类抑制剂底物结合的模式进行了实验，发现EPZ015666能够有效地抑制许多细胞株的体外生长，但缺乏肿瘤细胞株选择性，并且它对肿瘤细胞的抑制能力与细胞中MTAP的状态无关，这就有可能在临床试验中转化为潜在的毒性［28，47］。在MTAP缺乏的细胞中，MTA累积并部分抑制细胞中的PRMT5，使肿瘤细胞对PRMT5抑制剂敏感。这可能提供一个新的结合思路，设计一种小分子协同MTA与PRMT5结合，并特异性结合MTA：PRMT5复合物，从而抑制肿瘤细胞生长。

总之，随着对PRMT5生化功能的进一步研究，各类化合物与PRMT5结合的共晶结构的不断被报道，安全的PRMT5抑制剂逐渐被人们所发现并最终应用于临床，使肿瘤患者获益。