重金属镉抗性菌的筛选及促生、修复效果

何 欢，谢若兰，丁森旭，余 江,2,3

1)四川大学建筑与环境学院，四川成都610065；2)四川大学新能源与低碳技术研究院，四川成都610065；3)四川大学宜宾产业技术研究院，四川宜宾 644010

由于污灌、矿山开采和冶炼等人为活动，重金属镉(Cd)愈来愈多地暴露在环境中．Cd毒性较大，对粮食安全造成了极大危害[1]．因此，对Cd污染农田的治理与修复已迫在眉睫．

单一重金属修复技术均具有一定局限性，微生物-植物联合修复技术由于成本低和安全绿色等优点，受到广泛关注[2]．植物促生菌是一种附着于土壤或者植物根际的菌类，近些年来被广泛用于土壤重金属污染修复研究领域[3]．植物促生菌能够合成植物生长发育所必需物质，增加富集植物生物量，提升植物萃取能力[4]．另一方面，植物促生菌还可改良土壤肥力，将土壤中氮、磷和钾转换为植物易获取态，提升富集植物对土壤重金属的富集效果[5]．在实际应用方面，植物促生菌-植物联合修复体系对修复土壤重金属Cd污染方面拥有巨大潜力．MA等[6-7]报道了植物促生菌能显著增加伴矿景天和香根草对Cd的富集能力．但从矿区周边污染土壤中筛选植物促生菌，探究本土微生物对土壤理化性质和Cd赋存形态的影响却鲜见报道．因此，本研究在中国四川省川南地区某硫铁矿区周边污染农田采集植物根际土壤，以重金属压力培养法及菌株促生特性进行初筛，通过室内盆栽实验，探究所筛选菌株对黑麦草的富集效果，以及对土壤理化性质和Cd赋存形态的影响，以期为Cd污染农用地的修复策略提供参考．

1 材料与方法

1.1 实验仪器

本实验所用仪器有：UV2350紫外分光光度计(上海-尤尼柯仪器有限公司生产)、LDZX-50KBS高压灭菌锅(上海申安医疗器械厂生产)、HZQ-X500C恒温振荡器(上海一恒科学仪器有限公司生产)、SW-CJ-1FD型单人单面净化工作台(苏州净化设备有限公司生产)、JSM-7500F扫描电子显微镜(日本捷欧路公司生产)和303-2A电热恒温培养箱(绍兴市严氏风机有限公司生产)．

1.2 培养基的配置及灭菌条件

LB(Luria-Bertani)培养基(1 L)： 胰蛋白胨10.0 g， 酵母浸出粉5.0 g， NaCl 10.0 g， 蒸馏水1 L， pH值为7.0～7.4． 配制LB固体培养基时加入1.5%～2.0%(质量分数)琼脂粉．

无铁培养基(1 L)：MgSO4·7H2O 2.5 g，KH2PO42.5 g，甘油0.5 g，酪蛋白胨5.0 g，蒸馏水1 L，pH值为7.0～7.2．

无机磷培养基(1 L)：葡萄糖10.0 g，Ca3(PO4)25.0 g，MgCl25.0 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，KCl 0.2 g，(NH4)2SO40.1 g，蒸馏水1 L，pH值为7.0．

灭菌条件：121 ℃，0.155 MPa，30 min．

1.3 实验土壤及高浓度耐受镉菌株筛选

本实验菌株所用土壤系中国四川省川南地区某硫铁矿区受污染农田土，总镉含量为3.47 mg/kg，有效态镉含量为1.30 mg/kg．蒸馏水溶解3.0 g原土装于三角瓶后，放置恒温振荡器中20 min．超净台中接种已灭菌LB培养基，接种量为1.5%．通过测定促生特性及高浓度Cd压力培养法[8]，菌株在Cd的质量浓度为250 mg/L的质量培养基上稳定生长后，采用平板划线法进行分离纯化．保存1.5 mL菌液进行细菌种属鉴定．

促生特性的测定：菌株产吲哚乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)的测定参考文献[9]的方法，产铁载体能力测定参考文献[10]的方法，溶磷能力测定参考文献[11]的方法．

生长曲线的测定：将上述分离纯化后菌液接种于已灭菌LB培养基， 接种量为1.0%． 依次添加10 g/L 的Cd2+母液，使LB培养基中Cd2+的质量浓度为0～250 mg/L，采用D(600)值测定微生物生长曲线．

1.4 基因组DNA提取和PCR扩增

基因组DNA用DP336试剂盒提取．菌种鉴定通用引物为27F(5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTA CCTTGTTACGAC-3′)．聚合酶链反应(polyonerase chain reaction, PCR)体系：I5 Mix 25 μL，PF(10P)1 uL，PR(10P)1 μL，gDNA 1 μL，dH2O 22 μL．PCR扩增条件：98 ℃ 预变性3 min，39个循环(98 ℃变性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s)，72 ℃ 延伸5 min，4 ℃保留．PCR产物电泳条带切割所需DNA目条带，纯化的PCR产物用引物直接测序．待测菌种送至北京擎科伟业生物技术公司进行测序．用NCBI的Genbank进行Blast比对，确定菌株分类．

1.5 实验设计

设计空白对照组(CK)、YXL1、黑麦草、YXL1+黑麦草共4个实验组，每组设置3个平行对照组，共计12盆，每盆装土1.0 kg，栽植50株黑麦草，草籽购买自成都绿牧天下科技有限公司．

1.6 样品采集及数据分析

土壤：黑麦草栽种45 d后，采集根际土壤，自然风干，研磨后封存，测定pH值和有机质、速效钾、全氮、有效磷的质量浓度[12]．镉赋存形态采用BCR连续提取法[13]进行测定，每步结束后采用0.45 μm 聚醚砜树脂滤头过滤定容至10 mL离心管，4 ℃保存待测．

植物：黑麦草栽种45 d后，小心采集黑麦草植株样品，用超纯水洗净，放入烘箱在105 ℃杀青30 min，70 ℃烘干至恒重[14]．称量测重，随后加5 mL硝酸进行微波消解，4℃保存待测．

重金属：用ICP-MS测定Cd含量，检出限为1 μg/kg．

数据分析：运用Microsoft Excel 2010和SPSS 22.0进行数据统计分析，OriginPro 10.1制图．

2 结果与讨论

2.1 促生菌株(重金属抗性菌)促生特性分析

IAA是一种植物活性生长素，在调节植物生长和缓解重金属胁迫方面有重要作用．SALAZAR等[15]发现IAA可以改善植物根系微生态环境，加强富集植物对土壤重金属的富集能力．在镉的质量浓度为250 mg/L时分离出7种菌株，命名为YXL1～YXL7．测定7种菌株生产IAA、铁载体以及溶磷的能力(表1)．从表1可知，YXL1生产IAA的能力最强，为31.56 mg/L，表明YXL1菌株具有较强的促生能力．当植物根际铁元素含量较少时，微生物分泌对Fe3+具有较强络合作用的小分子物质，即铁载体．铁载体通过与重金属配位、螯和等多种化学作用，将重金属从土壤中溶出，转变为植物易提取态[16]．在实际应用中，铁载体能够促进植物对土壤中Cd的萃取[17-18]．本研究中除YXL5外，其他6种菌株的产铁载体能力均大于0.5，原因可能是受试土壤周边存在历史遗留硫铁矿矿渣堆体，从而导致铁元素土壤背景值含量较高，使得微生物产铁载体能力较弱．植物促生菌的溶磷能力能够加快土壤中的无机磷向植物易吸收形态转化的进程．KUMAR等[19]发现具有溶磷能力的细菌可以增加小麦产量．YXL1和YXL2有较强溶磷作用，分别为46.18 mg/L和34.89 mg/L，表明YXL1和YXL2具有较强的将土壤中磷转换为植物易获取磷的能力．通过产IAA、产铁载体与溶磷能力，综合筛选出YXL1为促生特性最优细菌，用于开展后续室内盆栽实验．

2.2 重金属抗性菌的分离、鉴定结果分析

通过高质量浓度Cd压力培养法，YXL1在接种3次并稳定生长后，采用平板划线法进行分离纯化，于LB培养基中发现该菌株呈淡黄色、圆润、有光泽、中间略微隆起，见图1(a)．通过扫描电子显微镜(scanning electron microscopy, SEM)发现菌株呈长杆状，见图1(b)，平均长度为5 μm．表明高浓度Cd2+并未明显改变细胞形态，YXL1对Cd2+具有较强的耐受能力．

国内外已发现多种能够促进植株生长的根际微生物[20-21]，表明植物促生菌种属对于构建微生物库至关重要．在NCBI的GenBank中进行Blast比对，发现YXL1与伯克霍尔德氏菌株同源性为99%，可确定YXL1菌株为伯克霍尔德氏菌．利用Neighbor-Joining方法构建YXL1菌株系统发育树，各节点平均置信度高于70(图2)．

图2 基于16S rDNA的YXL1菌株系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of YXL1 based on 16S rDNA

将YXL1以1%接种量接种于100 mL三角瓶中，培养24 h，测定菌株生长曲线(图3)．由图3可见，在0～5 h，YXL1细菌处于适应期，生长速率较为平缓，于5～20 h迅速繁殖，20 h后达到生长稳定期．此外，Cd2+对细菌生长具有较强的抑制作用，添加Cd2+时D(600)值小于未添加Cd2+时，表明Cd2+对YXL1生长有较强抑制．当Cd质量浓度大于200 mg/L时，在前11 h培养时期，YXL1生长曲线较为平缓，表明YXL1菌株对高浓度重金属培养液需要一个适应过程，但11 h后开始迅速分裂繁殖，对Cd2+表现出极高的抗逆性和耐受性．

图3 YXL1菌株在不同Cd2+质量浓度下的生长曲线Fig.3 Growth curve of strain YXL1 under different Cd2+ concentration stress

2.3 YXL1菌株可增强黑麦草对重金属镉的修复效果

土壤的pH值对Cd赋存形态具有决定性作用[22]．添加YXL1菌株后，土壤的pH值略微增高，但无显著差异．YXL1对黑麦草修复Cd污染土壤效果的影响见表2. 由表2可知，与CK组相比，单独施加YXL1时，土壤中有效磷的质量浓度增加了1.04 mg/kg．与黑麦草联合使用时，土壤有效磷的质量浓度进一步增加，各处理组有效磷的质量浓度分别为CK组的1.12、1.17和1.30倍，由此也验证了YXL1菌株应用在实际盆栽实验中同样具有较高的溶磷能力．此外，YXL1+黑麦草组中的有机质质量浓度显著增加，高达25.05 g/kg，原因是添加YXL1后，土壤酶活性增强，进而土壤有机质含量增加[23]．微生物与植物共同构成土壤微生态系统，系统内部相互影响、相互作用．在YXL1+黑麦草联合体系中，重金属赋存形态及黑麦草生物量均发生显著变化． 与黑麦草对照组相比， YXL1+黑麦草的株高和干质量分别为30.10 cm和1.67 g，分别增加17.12%和49.11%，由此印证了YXL1菌株对黑麦草生长具有显著促进作用．YXL1增加了土壤中重金属Cd的流动性，土壤中弱酸可提取态Cd和还原态Cd分别达到了16.25%和12.53%，提高了黑麦草对重金属的富集能力．

由于黑麦草具有生长周期快，抗外界干扰能力强和耐寒等特点，常作为重金属富集植物用于修复重金属污染土壤．从表2可知，与黑麦草对照组相比，YXL1+黑麦草对植物中Cd的富集量达0.58 mg/kg，提高了2.76倍．若按照每平方米土地种植3 000株黑麦草、每年种植3季、耕作层为0～20 cm、土壤容重为1 100 kg/m3推算，春耕种植低积累作物，冬季休耕时种植黑麦草对土壤中重金属Cd进行萃取，该矿区周边农用地耕作层重金属Cd含量在4 a后可降低到《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准(试行)》(GB 15618—2018)规定的风险筛选值(0.3 mg/kg)以下，从而大大降低重金属Cd对人体危害，实现矿区周边重金属污染农用地的安全利用．

表2 YXL1对黑麦草修复Cd污染土壤效果的影响Table 2 Effect of strain YXL1 on remediation of Cd contaminated soil by ryegrass

3 结 论

1)通过重金属压力实验以及促进菌筛选实验，从污染矿区原土中筛选出一株具有较强促生能力且耐高质量浓度重金属镉的植物促生菌(重金属抗性菌)Burkholderiasp.YXL1．

2)YXL1与黑麦草联合处理后，土壤有机质和有效磷含量大幅度提升．与黑麦草单独处理相比，YXL1能显著增加黑麦草生物量，并能将重金属从土壤中溶出，以提升黑麦草对Cd的富集能力．

3)将YXL1+黑麦草以间套种耕作方式处理重金属镉污染农用地，测算4 a后土壤中Cd含量可降低到《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准(试行)》(GB 15618—2018)规定的风险筛选值(0.3 mg/kg)以下，表明YXL1可作为一种微生物修复材料修复Cd污染农田且具有良好应用前景．