巨细胞病毒UL144对SD幼鼠肝细胞损害的分子机制

温正旺陈益平任迪索胡玲珑石海矾陈洁

1温州医科大学附属第二医院育英儿童医院儿童感染科，浙江温州325000；2温州医科大学仁济学院，浙江温州325000

人巨细胞病毒（HCMV）是引起婴幼儿肝炎常见的病原体[1]。HCMV肝炎占婴幼儿肝炎综合征的30%～40%，临床表现多样（无症状感染、胆汁淤积肝炎甚至胆道闭锁），尤其是亚临床型肝炎最为常见，严重危害婴幼儿的健康及生长发育。人群普遍感染HCMV，其特异性IgG抗体阳性率可高达90%。国内流行病学调查发现，婴幼儿HCMV-IgG抗体阳性率高达70%～90%[2]。HCMV感染临床表现差异巨大，考虑与基因相关，HCMV中含有数百个基因型，其中UL144基因型与HCMV的毒力密切相关，在部分HCMV感染肝功能正常患儿体内表达阴性，是导致婴幼儿HCMV肝炎的潜在重要因素，但其具体的病理、生理机制尚不明确。近期本课题组临床研究证实婴幼儿HCMV肝炎与caspase系列蛋白介导的细胞信号凋亡通路密切相关[3]。本文通过建立动物模型，并检测各组中UL144 RNA，caspase-8、caspase-12及Toll样受体4（TLR4）的蛋白和肝脏细胞的凋亡情况，探索UL144在HCMV感染肝脏损伤中的内在分子机制。

材料与方法

一、动物及分组

取体重为80～100 g健康雄性SD幼鼠 （3～4周龄）24只，均由温州医学院试验动物中心提供，合格证号为[SYXK（浙）2016-0061]。按随机数字表法分为空白组、空载组和实验组3组，每组各8只。空白组不作特别处理；空载组尾静脉注入100μL的空载腺病毒；将344μL病毒原液用0.9%生理盐水稀释成1.2 mL，然后每只尾静脉注入100 mL UL144，滴度为2.0×1012，建立UL144动物模型，建立后饲养1周，使药物效果稳定。

二、主要试剂

原位缺口末端标记（TUNEL）试剂盒（罗氏公司）；鼠浓缩型免疫组化试剂盒 （北京中杉金桥公司）；RT-PCR试剂盒 （Fermentas公司）；Trizol抽提试剂（北京普利莱基因技术有限公司），幼鼠UL144基因AAV9型号：200μL*5（唯真生物科技有限公司）。

三、研究方法

1.取材

实验结束次日，SD幼鼠迅速断头处死，取出肝脏右叶，生理盐水将血液冲洗干净，每组共得8个肝脏右叶样本，每组1～4号用4%多聚甲醛固定12 h后，石蜡包埋，分别连续切片，待测HE、TUNEL；其余均置液氮保存，每组5～8号用于RT-PCR法检测UL144 RNA，ELISA检 测caspase-8、caspase-12和TLR4的蛋白表达。

2.肝脏右叶细胞HE染色和凋亡检测

采用HE染色观察肝脏右叶细胞病理改变；采用TUNEL法，按试剂盒提供方法操作。镜检细胞核中绿色荧光者为凋亡细胞，随机计算5个高倍视野（×400）下的凋亡细胞数。凋亡指数（AI）以凋亡细胞/100个细胞（%）表示。

3.RT-PCR法测定SD幼鼠UL144 RNA的表达

按照Trizol提取试剂说明书抽提RNA，并测定RNA浓度，按RNA逆转录试剂盒（Fermentas公司）说明书进行逆转录，按实时荧光定量PCR操作要求在96孔中加入引物 （由上海基康生物工程有限公司合成）、SYBR GreenⅠ、模板、水总体积为20μL，混匀后在罗氏LightCycler480进行实时定量PCR分析，用Lightcycler480 15.0软件处理实验结果。

4.ELISA方法检测肝脏组织中caspase-8、caspase-12及TLR4的表达水平

ELISA试剂盒为美国PeproTech公司制造；抗caspase-8、caspase-12及TLR4抗体由Abcom公司生产。caspase-8、caspase-12及TLR4的酶联免疫试剂盒室温下放置30 min，每孔加50μL匀浆或标准样品，留两孔空白对照；薄膜盖住微孔板，孵育2 h；洗板4次，将酶标板反转，将洗涤液轻甩干；每孔加50μL抗caspase-8、caspase-12及TLR4抗体并封板，孵育2 h；洗板4次，酶标板反转，洗涤液彻底甩干；每孔先后滴入显色剂A及B，遮光下常温静置30 min；滴终止液100μL，在450 nm处检测吸光度值（OD）；以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，根据OD值计算其浓度。

四、统计学方法

本研究采用SPSS18.0软件进行统计处理。各组呈正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验，计数资料应用χ2检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、HE染色

光镜下形态学变化：实验组肝脏细胞出现变性，细胞核浓缩，深染增加，空白组和空载组基本正常（详见图1）。

图1 三组幼鼠肝脏的HE染色(HE染色，×100)

二、肝细胞凋亡情况

图2可见，各组间幼鼠离体肝组织细胞凋亡差异均有统计学意义（F=158.427，P<0.05）；实验组肝细胞的凋亡指数为7.68±0.37，明显高于空载组的2.26±0.24及空白组的2.38±0.16（P<0.05），空白组和空载组两者之间差异无统计学意义（P>0.05）。

图2 三组幼鼠肝脏的TUNEL检测结果(TUNEL法和DAPI核染检测，×400)

三、 肝 脏 组 织 UL144、caspase-8、TLR4 和caspase-12的表达量

表1可见，三组间幼鼠肝脏内的UL144 RNA、caspase-8和TLR4蛋白表达量的差异有统计学意义（F=156.166、97.287和67.624，P均<0.05），其中实验组的表达量分别为1.823±0.080、0.305±0.004和0.880±0.068，高于空载组及对照组（P均<0.05）；空载组的表达量分别为1.000±0.040、0.104±0.003和0.308±0.004，均高于空白组（P均<0.05）。 三组间幼鼠肝脏组织中caspase-12蛋白表达差异无统计学意义（F=2.156，P>0.05）。

表1 各组幼鼠肝脏组织UL144 RNA、caspase-8、TLR4、caspase-12表达量的比较

讨 论

HCMV是一种广泛分布的机会致病性病毒，具有潜伏性感染特点。HCMV含有免疫逃避基因，可干扰宿主自身的细胞因子系统，影响APC的抗原提呈功能。HCMV感染易引起机体宿主细胞凋亡，而HCMV具有许多抗凋亡的机制和CTL杀伤机制，使感染细胞长期存活[4]。上述方式相互作用使病毒感染后处于静息平衡状态，当机体免疫功能低下时，病毒大量复制发生显性感染。临床发现，当HCMV感染时，一部分表现为亚临床型肝炎、黄疸型肝炎、无黄疸型肝炎、胆汁淤积性肝炎和胆汁淤积症，大部分仅提示存在HCMV感染[5]；HCMV感染临床症状差异巨大，原因是HCMV中存在与病毒毒力相关的亲嗜性基因，而亲嗜性基因如何诱导肝细胞损伤目前尚未完全明确。

早期研究发现，巨细胞病毒ULβ区基因与巨细胞病毒的毒力和感染力相关，但UL144和UL146作用最明显，如何相关目前尚未明确[6]。本研究中发现当给予幼鼠腹腔注射，HCMV UL144蛋白时，SD幼鼠肝脏细胞HE染色提示出现不同程度的变性，TUNEL法检测出现不同程度的凋亡，提示HCMV UL144基因片段可以导致幼鼠肝细胞损伤乃至凋亡。先前的研究提示，HCMV感染导致肝功能损伤与caspase系列蛋白密切相关，caspase系列蛋白成分复杂，介导的信号通路很多，例如caspase-9参与介导的线粒体途径诱导的细胞凋亡，caspase-8参与传递的细胞外信号凋亡通路，caspase-12参与诱导的内质网应激细胞凋亡信号通路[7]。研究提示，HCMV感染可激活内质网应激信号通路，内质网应激信号通路的激活参与了HCMV感染肝功能的损伤[8]。本实验发现，UL144蛋白进入SD幼鼠体内导致肝细胞的损伤乃至凋亡，但是caspase系列蛋白中介导内质网应激信号通路激活的caspase-12的表达与空白组的比较无明显差异，提示它与HCMV UL144的感染力与毒力之间不存在相关性，但不能认定UL144与内质网应激之间无相关性。本研究还发现，实验组的caspase-8明显高于另外两组，差异具有统计学意义，且caspase-8是caspase系类蛋白中直接参与细胞凋亡的，UL144可能通过激活caspase-8效应分子诱导肝细胞凋亡。有研究揭示，HCMV感染诱导细胞凋亡的整个过程中，细胞内TLR家族蛋白作为炎症启动器起到重要作用，尤其是TLR4，研究发现TLR4主要通过caspase系列蛋白酶的激活起作用[9]。本研究中显示，相较于其他两组，实验组的TLR4表达明显升高，提示在病毒感染后，TLR4被激活，介导的caspase-8效应分子参与了HCMV感染导致肝细胞损伤乃至凋亡的病理生理过程。

综上所述，关于HCMV感染导致肝脏损伤，传统的一些靶点已经满足不了临床的需要，亟需寻找确实可行的研究方向及靶点。本研究从基因片段入手，将炎症启动因子TLR4以及凋亡效应分子caspase-8引入HCMV感染导致肝功能损伤的研究中，并确实发现HCMV UL144感染后幼鼠体内TLR4和caspase-8表达出现明显上升，提示UL144可能通过激活TLR4并介导caspase-8参与了HCMV感染肝细胞损伤的病理生理过程，将为HCMV感染肝损伤提供一个全新的靶点及理论依据。但是本文在小鼠体内注入UL144后虽然发现体内一些与细胞凋亡相关的细胞因子表达出现显著变化，但未通过抑制剂对TLR4与caspase-8之间的相关性进行深入研究，将在今后予以观察。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突